急性ITP患兒外周血Tr細胞及其與IL-2的相關性研究①

宋 麗 金呈強 劉 仿 杜寧超 肖 紅 (廣東醫學院微生物與免疫教研室,湛江524023)

CD4+CD25+Foxp3+T調節性T細胞(regulation T cell,Tr細胞)是維持機體免疫耐受的重要調控者,在自身免疫病中的作用已引起關注。急性特發性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)患兒外周血中Tr細胞數量的減少及相關細胞因子(IL-10、TGF-β)含量的降低,與急性ITP患兒的細胞免疫失調有關。而IL-2是Th1類細胞因子,IL-2能否促進或抑制Tr細胞的增殖尚未見報道。為探討ITP患兒Tr細胞數量受細胞因子IL-2的影響狀況,我們用流式細胞術和ELISA法分析患兒外周血中Tr細胞及細胞因子IL-2的變化。

1 材料及方法

1.1 研究對象 35例急性ITP患兒系廣東醫學院附屬第一醫院和附屬湛江中心醫院住院病人,急性ITP患兒均符合急性ITP診斷標準,正常對照為30例健康體檢者,詳細情況見表1。

1.2 試劑和儀器 PerCp-抗人CD3 mAb,FITC-抗人CD4 mAb和APC-Cy7-抗人CD8 mAb,流式細胞檢測試劑均購自BD公司。鼠抗人IL-2mAb(mAHuIL-2)為Biosource公司產品。流式細胞儀為美國BD公司產品(型號:FACSCanto),酶聯儀為 Biotek公司ELX800型。

1.3 方法

1.3.1 外周血CD4+CD25+Foxp3+T細胞檢測 取未刺激的外周肝素抗凝全血50μl后加入10μl的CD4-FITC與CD25-APC cocktail,并于4℃下避光孵育30分鐘以標記CD4+CD25+T細胞;經溶血洗滌后使用1 ml Fixatior/Perm緩沖液穿膜45分鐘,而后用洗滌緩沖液洗滌后加入1μl正常鼠血清于4℃封閉15分鐘,之后直接加入 10μl PE-抗人 Foxp3 mAb,于4℃避光孵育30分鐘。經洗滌緩沖液洗滌2次后用300μl染色緩沖液重懸并上FACSCanto流式細胞儀檢測。

1.3.2 IL-2的檢測 患兒和健康兒童肝素抗凝血5 ml,室溫靜置 30分鐘后,離心分離血漿凍存于-70℃。同批用ELISA法分別測IL-2的含量。

1.4 統計學處理 全部數據均經SAS 8.22統計軟件分析。數據用±s表示,兩變量的相關程度用直線相關分析法,以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 急性ITP患兒及正常對照兒童組外周血中CD4+CD25+Foxp3+T細胞的數量及IL-2的檢測 結果見表2、3。ITP患兒外周血中CD4+CD25+Foxp3+T細胞顯著低于對照組(t=2.19,P＜0.05),CD4+CD25+Foxp3+T細胞在總CD4+T細胞中所占比例也低于對照組(χ2=74.08,P＜0.05),急性 ITP組IL-2含量明顯低于對照組[(45.62±9.35)pg/ml VS(28.38±13.87)pg/ml,t=9.05,P＜0.01)]。

表1 急性ITP組和正常對照組一般資料比較Tab.1 The contrast data of acute ITP with normal group

表2 急性ITP組與對照組外周血T細胞亞群及IL-2比較(±s)Tab.2 The contrast of T cell′s subpopulation and IL-2 in blood between acute ITP and contrast group(±s)

表2 急性ITP組與對照組外周血T細胞亞群及IL-2比較(±s)Tab.2 The contrast of T cell′s subpopulation and IL-2 in blood between acute ITP and contrast group(±s)

Note:1)P＜0.05.

Groups n CD4+T cell(%)Tr cell/CD4+T cell IL-2(pg/ml)Acute ITP 35 27.37±5.591)0.11±0.041)28.38±13.871)Control group 30 35.32±2.27 0.15±0.02 45.62±9.35

表3 急性ITP組與對照組外周血T細胞亞群及Foxp3的比較Tab.3 The contrast of T cell′s subpopulation and Foxp3 in blood between acute ITP and contrast groups

圖1 急性ITP患者血漿IL-2含量與Tr細胞的相關性分析Fig 1 The pertinency analysis between IL-2 and Tr cell in plasama of ITP

2.2 CD4+CD25+Foxp3+T細胞與細胞因子IL-2的相關性 急性ITP組外周血中CD4+CD25+Foxp3+T細胞所占CD4+T細胞的比例與IL-2的水平呈正相關(r值為0.86,P＜0.05)見圖1。

3 討論

急性特發性血小板減少性紫癜是兒童常見的一種免疫性出血性疾病,發病機制不明,迄今尚無特異而有效的治療方法。近年來研究發現,細胞免疫在ITP的發病機制中扮演著極其重要的角色。ITP患者體內可檢測到自身反應性CD4+T細胞,這些T細胞能輔助B細胞產生針對血小板表面糖蛋白的自身抗體[1],CD4+自身反應性T細胞的異常激活是ITP發病機制的始動環節之一[2]。另外發現急性ITP患者中Th1細胞增多、Th2細胞減少,反映Th1細胞功能的細胞因子(如IL-2、INF-γ、IL-6和血清可溶性IL-2受體sIL-2R)血漿水平明顯升高[3],而與Th2細胞功能密切相關的細胞因子IL-4和IL-6水平則明顯降低,證實ITP是一種Th1優勢的自身免疫病[4,5]。CD4+CD25+Treg細胞為一種自然發生的、胸腺來源的T細胞,是一種具有免疫抑制功能的T細胞亞群,該細胞能抑制自身反應性T、B細胞的活化和增殖,以及自身抗體的產生,CD4+CD25+調節性T細胞在維持機體自身免疫耐受中發揮重要作用。Tr細胞的數目減少或功能失調均可引起自身免疫性疾病[6]。最新的研究表明,在急性和慢性難治復發性的ITP患者外周血中,調節性細胞的數量顯著低于緩解的患者和健康志愿者,且該細胞的抑制功能也明顯出現障礙,證實調節性T細胞的數目減少和功能缺陷可能為ITP免疫紊亂的參與機制之一[7,8]。另外,急性ITP患兒外周血中Tr細胞數量減少,CD4+CD25+T細胞相關性細胞因子IL-10、TGF-β的表達水平也降低,IL-7則對Tr細胞數量的變化產生一定的影響[9,10]。Tr細胞活化后分泌大量的IL-10、TGF-β等抑制性細胞因子,其功能通過這些抑制性細胞因子來實現[11]。

IL-2主要由T細胞或T細胞系產生。目前關于IL-2的生物學作用大都是體外實驗的結果。IL-2具有以下生物學作用:①Th和Tc細胞都是IL-2的反應細胞:IL-2對靜止T細胞作用較弱。胸腺細胞和T細胞經抗原、有絲分裂原或同種異體抗原刺激活化后有在IL-2存在的條件下進入S期,維持細胞的增殖。IL-2可刺激T細胞轉鐵蛋白受體(TfR,CD71)、胰島素受體、MHCⅡ 類抗原的表達,并產生多種淋巴因子如 IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-β及 CSF等。②誘導CTL、NK和LAK等多種殺傷細胞的分化和效應功能,并誘導殺傷細胞產生 IFN-γ、TNF-α等細胞因子。IL-2可增強CTL細胞穿孔素(perforin)基因的表達。③直接作用于B細胞,促進其增殖、分化和Ig分泌。已發現IL-2R也可存在于活化的B細胞中,IL-2對B細胞的調節作用除通過刺激T細胞分泌B細胞增殖和分化因子外,還可能有直接的調節作用。④活化巨噬細胞。但IL-2對Tr細胞的作用至今尚未見文獻報道。

以上研究表明,ITP患兒外周血中CD4+CD25+Foxp3+T細胞顯著低于對照組(t=2.19,P＜0.05),CD4+CD25+Foxp3+T細胞在總CD4+T細胞中所占比例也低于對照組(χ2=74.08,P＜0.05),急性ITP組IL-2含量明顯低于對照組[(45.62±9.35)pg/ml VS(28.38±13.87)pg/ml,t=9.05,P＜0.01)]。他們含量的減少使有效的免疫抑制作用降低,導致自身反應性T細胞激活增多、凋亡減少,促進了血小板的破壞。

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