外周血輔助性T細胞亞群與肺結核嚴重性及療效的關系①

李德憲 張天托 譚守勇 張賢蘭 (中山大學附屬第三醫院呼吸科,廣州 510630)

宿主受結核分枝桿菌感染后近期內發病乃至以后發病者僅約10%,且發病者臨床表現差異極大,宿主感染后發病與否,及發病的嚴重程度等,不僅與感染的細菌量及其毒力等因素有關,而且還取決于機體的免疫功能。目前認為機體的抗結核免疫反應主要是通過T淋巴細胞介導巨噬細胞效應的細胞免疫反應,CD4+T細胞按細胞因子產生的模式和生物功能可分為Th1細胞和Th2細胞。為探討:外周血的Th1和Th2細胞與肺結核病變嚴重程度的關系;抗結核治療前后外周血的Th1和Th2細胞的變化;外周血的Th1和Th2細胞及其變化與療效的關系;我們進行此研究。

1 材料與方法

1.1 研究對象 肺結核患者組:共62例,其中男48例,女14例,年齡 16～88 歲,平均 50.24±20.45歲 。所有患者均符合《肺結核診斷和治療指南》的診斷標準[1],均具有細菌學或病理學陽性依據。本組肺結核患者無合并糖尿病、艾滋病、甲狀腺功能亢進及其他自身免疫性疾病,治療前未使用免疫調節劑。肺部病灶受累程度分級標準:局限病變是指肺部病灶累及范圍少于或等于2個肺野;多葉受累是指肺部病灶累及范圍多于2個肺野。療效判斷標準:明顯吸收是指治療后病灶吸收或縮小大于或等于50%以上;吸收不明顯是指治療后病灶吸收或縮小不足50%;惡化是指治療后病灶范圍較前擴大。62例肺結核患者中,局限組20例(單側局限13例,雙側局限7例),其中空洞形成5例(25.0%);多葉受累組42例(單側多葉4例,雙側多葉38例),其中空洞形成30例(71.4%)。治療后24例病灶明顯吸收好轉,38例病灶吸收不明顯。

健康對照組:共30例,其中男19例、女11例,年齡16～50歲,平均34.10±8.11歲。為影像學正常及近期無接觸結核病史的正常體檢者,PPD皮試為陰性或一般陽性,血清抗結核抗體陰性。

1.2 研究方法 患者入院一周內進行一下檢查:痰涂片找抗酸桿菌及痰結核菌培養;采集外周血查血常規、血沉(ESR)、C-反應蛋白(CRP)及Th細胞亞群檢測;胸部X-線照片(或)胸部CT檢查。明確診斷后,接受規則抗結核治療(應用異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇或鏈霉素四藥聯合治療),治療過程不使用免疫調節劑,抗結核治療2月后復查(項目與入院時檢查相同)。

Th細胞亞群檢測:采用細胞內細胞因子測定法,以胞內INF-γ的表達代表Th1細胞,IL-4的表達代表Th2細胞進行分型,通過流式細胞技術測定。XL-4型流式細胞儀為Beckman Coulter公司產品;TC2323 CO2培養箱為SL公司產品。主要熒光標記單克隆抗體:及相應的同型對照,以及檢測抗體所用的絕對計數微球、破膜及固定劑均為Immunotech公司產品;佛波酯、離子霉素、莫能霉素、二甲亞砜、含鏈霉素青霉素磷酸鹽緩沖液等為Sigma公司產品;1640培養液、滅活胎牛血清為Gibco Bre公司產品。嚴格按說明書要求操作。

1.3 統計學分析 采用SPSS10.0統計軟件進行統計分析;計量資料采用±s表示平均水平,兩樣本均數的比較用t檢驗,治療前后計量資料變化的比較用配對 t檢驗;計數資料的比較用 χ2檢驗;P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 治療前肺結核組與健康對照組的Th1和Th2細胞計數比較 見表1,肺結核組的Th1和Th2細胞的計數均明顯低于對照組。

表1 治療前肺結核組與健康對照組的Th1和Th2細胞計數比較Tab.1 Comparison of Th1 cell count and Th2 cell count between tuberculosis group and controls before antituberculosis therapy

表2 治療前不同程度肺部病灶受累組肺結核患者的臨床特征比較Tab.2 Comparison of characteristics between diffuse group and limited group before antituberculosis therapy

2.2 治療前不同程度肺部病灶受累組肺結核患者的臨床特征比較 見表2,多葉受累組的血沉高于局限組,血紅蛋白及Th1細胞計數均低于局限組。另外,無論是多葉受累組還是局限組的Th1細胞計數和Th2細胞計數均低于健康對照組,其中Th1細胞計數在多葉受累組、局限組與健康對照組中呈逐漸增多趨勢。

2.3 治療前病灶吸收明顯組與病灶吸收不明顯組的臨床特征比較 見表3,治療前兩組的Th1、Th2細胞計數、血紅蛋白、血沉和C-反應蛋白均無統計學差異,但Th1和Th2細胞計數均較健康組低。

2.4 治療后病灶吸收明顯組與病灶吸收不明顯組的臨床特征比較 見表4,治療后病灶吸收明顯組的血沉和C-反應蛋白均低于病灶吸收不明顯組,病灶吸收明顯組的Th1細胞計數恢復至健康水平,病灶吸收不明顯組的Th1細胞計數仍低于健康水平,兩組Th2細胞計數仍均低于健康組。

2.5 病灶吸收明顯組治療前后的臨床特征比較

見表5,治療后除血紅蛋白、血沉和C-反應蛋白明顯改善外,Th1細胞計數亦較治療前有明顯增加,且與健康對照組比較無差異;Th2細胞計數則治療前后相似,仍低于健康對照組。

2.6 病灶吸收不明顯組治療前后的的臨床特征比較 見表6,治療后雖然白細胞計數、血沉和C-反應蛋白較前有改善,但血紅蛋白改變不大,且仍顯著低于健康組;Th1細胞計數雖較前有明顯增加,但仍顯著低于健康對照組;Th2細胞計數則較治療前有降低,明顯低于健康組。

表3 治療前病灶吸收明顯組與病灶吸收不明顯組的的臨床特征比較Tab.3 Comparison of characteristics between improved group and stable group before antituberculosis therapy

表4 治療后病灶吸收明顯組與病灶吸收不明顯組的臨床特征比較Tab.4 Comparison of characteristics between improved group and stable group after two months of antituberculosis therapy

表5 病灶吸收明顯組治療前后的臨床特征比較(n=24)Tab.5 Comparison of characteristics before and after two months of antituberculosis therapy in improved group(n=24)

表6 病灶吸收不明顯組治療前后的臨床特征比較(n=38)Tab.6 Comparison of characteristics before and after two months of antituberculosis therapy in stable group(n=38)

表7 病灶吸收明顯組與病灶吸收不明顯組前后的臨床特征變化的比較Tab.7 Comparison of characteristics before and after therapybetween improved group and stable group

2.7 病灶吸收明顯組與病灶吸收不明顯組治療前后的臨床特征變化比較 見表7,病灶吸收明顯組的Th1細胞計數的增加值顯著較病灶吸收不明顯組多,Th2細胞計數、血紅蛋白、血沉、C-反應蛋白的變化值則相似。

3 討論

傳統上,肺結核肺部病灶受累程度分級標準通常依據影像學上是否形成空洞病灶而劃分,如同是菌陰肺結核,有空洞者治療療程則須相應延長。有關肺結核病變的病理形成過程現已較明確,空洞是否出現是感染細菌的數量、毒力及機體免疫功能共同作用的結果,機體免疫力嚴重缺乏時,并不形成空洞,如艾滋病患者合并肺結核,多出現中下肺廣泛播散灶,但少見空洞形成,又如臨床上認為較危重的血行播散型肺結核也少見空洞形成,可見以空洞形成與否作為肺結核嚴重性的判斷標準存在不足。我們認為,由于結核病免疫反應具有不平衡性,在不同的肺葉,甚至同一肺葉乃至同一病變的不同部位可以同時存在處于不同病程的病變的特點,以肺部病灶累及范圍多少作為肺結核嚴重性的判斷標準更趨合理,此外以病灶播散程度來探討外周血中細胞的免疫功能也更科學。在我們研究的所有62例肺結核患者中,影像學顯示有空洞形成者35例,未見空洞者27例,按我們標準劃分,局限組20例,其中空洞形成5例(25.0%),多葉受累組42例,其中空洞形成30例(71.4%),多葉受累組空洞形成明顯高于局限組,兩組差異有顯著性統計學意義(P=0.001,χ2檢驗)。由于影像學觀察容易出現因閱片者不同而出現差異,為驗證我們的影像學分度的準確性,我們同時比較不同肺部病灶受累程度患者的血紅蛋白、C-反應蛋白和血沉,結果如表2所示,多葉受累組的血紅蛋白109.83±25.06(g/L)明顯低于局限組的128.95±17.29(g/L),血沉82.60±42.74(mm/h)明顯高于局限組的42.50±32.99(mm/h),C-反應蛋白67.14±65.33(mg/L)也高于局限組的42.01±68.74(mg/L),證實影像學結果與臨床表現的一致性。

自1986年Mosmann等[2]發現,小鼠CD4+T細胞按細胞因子產生的模式和生物功能,有兩種極不相同的亞群,分別稱為Th1細胞和Th2細胞以來,有關Th1/Th2的平衡與結核病的關系成為研究的熱點。由于研究樣本的種屬差異、個體差異、不同發病時期、不同嚴重程度、不同研究方法等,研究結果存在爭議,具體表現為同是外周血或同是病變部位的研究結果的不一致性,以及病變部位與外周血表現的差異。如在外周血研究方面,Zhang等[3]報道結核病人的外周血細胞的Th1反應型并不伴隨Th2反應增高;但Surcel等[4]報道活動性肺結核患者以Th2樣細胞數量增多為主,Th1細胞未見減少。Lienhardt等[5]報道了大樣本臨床研究結果,提示:外周血較低下的Th1型反應和/或更強的Th2型反應者,患結核風險更高;上調Th1型反應可能有助于提高抗結核療效。Handzel等[6]則認為急性結核病外周血Th1和Th2型反應均增強。Sahiratmadja等[7]發現活動性結核組的Th1型反應明顯低于對照組,且與疾病嚴重程度緊密關聯,病情越嚴重則Th1型反應越低,治療后Th1型反應可恢復至接近正常水平,結核組的Th2型反應則治療前稍高于對照組,治療后則降低至對照組水平。

由于結核病免疫反應具有不平衡性,在不同的肺葉,甚至同一肺葉乃至同一病變的不同部位可以同時存在處于不同病程的病變,因此,我們認為外周血液可能更能反映機體總體免疫狀況。另外,不同的發病時期,機體免疫反應也不相同,我們采用抗結核治療前后不同時期的動態比較可更好解決不同疾病時期免疫應答可能不同的問題。細胞內細胞因子測定能更直接、更準確地反映體內Th1及Th2細胞的實際情況。因此,本研究采用細胞內細胞因子測定法,以胞內INF-γ的表達代表Th1細胞,IL-4的表達代表Th2細胞進行分型,通過流式細胞技術,對不同嚴重程度的結核病患者及治療前后不同時期的外周血液進行Th細胞計數來研究結核病患者Th1/Th2細胞免疫應答失調與臨床病變嚴重程度、疾病轉歸、預后的關系。

本研究顯示,治療前肺結核患者Th1細胞計數低于健康者,而且肺部病灶受累程度越嚴重,Th1細胞計數則越低;治療后,肺部病灶吸收明顯者,Th1細胞計數升高得多,達到甚至超過健康水平,而病灶吸收不明顯者的Th1細胞計數雖然較治療前有明顯增加,但仍低于健康水平。與Zhang等[3]及Lienhardt等[5]的大型臨床研究報道一致。尤其是Lienhardt等的研究,雖然研究方法及選用的Th1型因子與本研究不同,但其研究也表明Th1型反應低下與結核病的發生有關,而且低下的Th1型反應在有效抗結核治療后出現明顯增加,甚至超過正常對照組,但兩者也存在一定區別,Lienhardt等研究顯示Th1型反應恢復性增加值達到甚至超過正常對照組的時間需在抗結核后6個月,而本研究僅需2個月,還有Lienhardt等是所有入選肺結核患者(無論治療反應如何)的平均反應,未對患者作進一步分層分析,而本研究顯示,并非所有肺結核病人經過抗結核治療后均可出現此反應,只有療效明顯者才會出現此變化,療效不明顯者Th1細胞計數雖然較治療前有明顯增加,但仍低于健康水平,推測結核病的發生和進展可能與Th1細胞低下有關,成功的抗結核治療后,Th1細胞隨之恢復,上調Th1型反應可能有助于提高抗結核療效。

有關Th2細胞方面,本研究顯示,治療前肺結核患者無論肺部病灶受累廣泛與否,Th2細胞計數均低于健康對照組,差異有顯著性統計學意義,而且病情輕重患者間Th2細胞計數并無差異;治療后,低水平的Th2細胞計數并不回升,在病灶吸收不明顯患者中甚至出現進一步下降趨勢。與Zhang等[3]及Lienhardt等[5]研究Th1型反應低下但Th2型反應相似或升高不同,可能與研究方法不同有關,Zhang等[3]及Lienhardt等[5]研究采用細胞外細胞因子測定方法,本研究采用細胞內細胞因子測定法。Lin等[8]用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法測定外周血及淋巴結內細胞因子表達的研究均提示結核病發病是以Th1型免疫反應低下為主,而非Th2型免疫反應增強,本研究這進一步證實這一發病機理。推測治療后好轉明顯患者,由于Th1細胞上升,有足夠的Th1型免疫保護,為維持Th1/Th2平衡,Th2細胞亦出現輕微的上調;而病灶吸收不良患者,由于治療后雖然Th1細胞較前有一定升高,但仍遠低于健康者,為維持足夠的Th1型免疫保護機體,而下調Th2細胞。

綜上所述,我們認為,結核病的發生和進展可能與Th1細胞低下有關,而非Th2型免疫反應增強所致,成功的抗結核治療后,Th1細胞隨之恢復。然而,免疫細胞和細胞因子的作用是復雜的和多方面的,在機體不同的狀態時,它們所起的作用也不相同,并且能夠被很多物質調節。目前,細胞因子的作用尚未徹底明了,相信隨著研究的深入,將有助于在抗結核治療中引入新的特異性免疫治療。

1 中華醫學會結核病學分會.肺結核診斷和治療指南[J].中華結核和呼吸雜志,2001;24(1):70-74.

2 Mosmann T R,Chewinski H,Bond M W et al.Two types of murine helper T cell clone.I.Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins[J].J Immunol,1986;136(7):2348-2357.

3 Zhang M,Lin Y,Dinakar V et al.T cell cytokine responses in human infection with mycobacterium tuberculosis[J].Infection and Immunity,1995;63(8):3231-3234.

4 Surcel HM,Troye-Blomberg M,Paulie S et al.Th1/Th2 profilesintuberculosis,based on the proliferation and cytokine response of blood lymphocytes to mycobacterial antigens[J].Immunology,1994;81(2):171-176.

5 Lienhardt C,Azzurri A,Amedei A et al.Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo[J].Eur J Immunol,2002;32(6):1605-1613.

6 Handzel Z T,Barak V,Altman Y et al.Increased Th1 and Th2 type cytokine production in patients with active tuberculosis[J].Isr Med Assoc J,2007;9(6):479-483.

7 Sahiratmadja E,Alisjahbana B,de Boer T et al.Dynamic changes in proand anti-inflammatory cytokine profiles and gamma interferon receptor signaling integrity correlate with tuberculosis disease activity and response to curative treatment[J].Infect Immun,2007;75(2):820-829.

8 Lin Y,Zhang M,Hofman F M et al.Absence of a prominent Th2 cytokine response in human tuberculosis[J].Infect Immun,1996;64(6):1351-1356.