壯族人群少精不育患者精細(xì)胞GSTT1和GSTM1基因研究①

陳文成 康熙雄 韋葉生 潘 云 周亞莉 張國(guó)軍 (右江民族醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,百色 533000)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì),全球有近6000萬(wàn)人罹患不孕癥,約占育齡人口的10%。其中近一半由男性因素所致,稱(chēng)為男性不育[1]。導(dǎo)致男性不育的原因很多,其中相關(guān)基因的突變是一個(gè)重要的因素。大量的研究表明,人體內(nèi)特別是生殖腺里的毒性物質(zhì)對(duì)精子的成熟和精液的質(zhì)量有很大影響,谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(Glutathione s-transferase,GST)能催化多種Ⅰ相酶代謝活化產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物與谷胱甘肽(GSH)巰基(-SH)共軛結(jié)合,形成親水性物質(zhì)排出體外,從而提高機(jī)體的解毒作用。GST幾乎廣泛存在于人體所有的細(xì)胞和組織,尤其在生殖腺、肝臟、結(jié)腸中表達(dá)較高,其基因的缺失和人體對(duì)環(huán)境中毒性物質(zhì)的解毒能力相關(guān),從而影響到精子的成熟和精液的質(zhì)量,導(dǎo)致男性不育。

本工作運(yùn)用PCR法對(duì)75名壯族少精不育患者精細(xì)胞GSTT1和GSTM1基因進(jìn)行多態(tài)性研究,探討壯族人群中該基因多態(tài)性與少精癥的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 實(shí)驗(yàn)組:75例均為少精癥(精子密度＜20×109L-1且精子形態(tài)正常在45%以下,精子活率在30%～60%之間),年齡25～40歲,平均 32歲,婚后不育年限2～8年,平均3.5年。所有患者性功能正常,無(wú)生殖系統(tǒng)器質(zhì)性病變及炎癥、阻塞等。檢測(cè)前抽靜脈血檢查染色體核型(G顯帶技術(shù))、抗精子抗體(ELISA)及血清激素水平,異常者不列入研究對(duì)象。對(duì)照組:36例為已生育且精液正常(精子密度≥20×109/L,A級(jí)精子＞25%或A+B級(jí)精子＞50%)的健康男性,年齡25～40歲,平均32.5歲。研究對(duì)象禁性生活3天后,取精液檢查,連續(xù)2次異常予以確診。精液標(biāo)本均來(lái)自右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,研究對(duì)象均為壯族人。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 精液DNA提取:吸取精液200 μ l,加1ml滅菌生理鹽水混勻,5 000 r/min離心5分鐘,棄上清,加STE直至加到溶液均一、不混濁,37℃水浴1 小時(shí) ,加蛋白酶K(終濃度 100 μ g/m1),55℃水浴3小時(shí),加等體積酚/氯仿,12 000 r/min離心5分鐘,吸上清于另一管中,加2倍體積無(wú)水乙醇。置-20℃沉淀30分鐘,12 000 r/min離心15分鐘。棄上清,自然干燥,加TE液10 μ l,混勻,4℃保存待用。

1.3 PCR反應(yīng)體系 引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[2]的報(bào)道,由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。GSTM1 引物:正向 5′-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3′,反向 5′-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3′;GSTT1 引物:正向 5′-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3′,反向 5′-TCACCGGATCATGGCCAGGCGCA-3′。 內(nèi)對(duì)照β-globin 基因引物:正向 5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′;反向 5′-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3′。 反應(yīng)體積為 25 μ l,含基因組 DNA 0.5 μ g,2.5 mmol/L MgCl2,200 μ mol/L dNTP,上下游引物各 0.5 μ mol/L,1U Taq DNA聚合酶。PCR循環(huán):94℃60秒,59℃30秒,72℃80秒,共32個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物加在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,電流45 mA,電壓100 V,電泳載樣緩沖液為1×TBE緩沖液,用溴乙錠染色,在紫外燈下觀(guān)察結(jié)果。

1.4 結(jié)果判斷 有電泳條帶者為GSTM1基因攜帶者(present),無(wú)顯示則為缺失(deleted)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的基因(型)頻率比較分析用 χ2檢驗(yàn),用SPSS軟件包進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)果判斷 精細(xì)胞基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后,將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物加在20 g/L瓊脂糖凝膠上電泳,用溴乙錠染色,在紫外燈下觀(guān)察結(jié)果,有電泳條帶者為GST基因攜帶者(present),無(wú)顯示則為缺失(deleted)。GSTT1 為 480 bp、GSTM1為 215 bp,內(nèi)對(duì)照 βglobin為268 bp,見(jiàn)圖1。

圖1 精細(xì)胞GSTM1和GSTT1基因電泳圖Fig.1 PCR product of GSTM1 and GSTT1 genes

表1 GSTM1基因分析Tab.1 Analysis of the GSTM1 genotypes AA,AG,and GG

表2 GSTT1基因分析Tab.2 Analysis of the GSTT1 genotypes AA,AG,and GG

表3 GSTM1和GSTT1基因分析Tab.3 Analysis of the GSTM1 and GSTT1 genotypes AA,AG,and GG

2.2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組GSTM1基因多態(tài)性比較 結(jié)果如表1,實(shí)驗(yàn)組的缺失型基因高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組GSTT1基因多態(tài)性比較 結(jié)果如表2,實(shí)驗(yàn)組的缺失型基因與對(duì)照組比較,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組GSTM1基因、GSTT1基因多態(tài)性同時(shí)比較 結(jié)果如表3,實(shí)驗(yàn)組的均缺失型基因與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

男子不育癥的發(fā)病原因復(fù)雜,多種因素均可以影響男性生育力,包括染色體異常、生殖道感染、睪丸生精功能異常、精子結(jié)構(gòu)異常和精漿異常、男性性功能障礙等。其中部分與遺傳因素有關(guān),深入研究各種基因變異導(dǎo)致生殖損傷的分子作用機(jī)理,可以進(jìn)一步揭開(kāi)男性不育的奧秘,從而維護(hù)和促進(jìn)人類(lèi)生殖健康。

GSTs是一組具有多種生理功能的超基因家族酶系[3]。它能催化機(jī)體內(nèi)有害極性化合物與谷胱甘肽相結(jié)合,還可由非酶結(jié)合方式將體內(nèi)各種潛在毒性代謝產(chǎn)物、染料致癌劑及親脂性化合物從體內(nèi)排出,從而參與機(jī)體內(nèi)抗氧化和保護(hù)細(xì)胞內(nèi)許多物質(zhì)合成、儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程[4],因此GSTs在解毒功能上起著重要作用,是參與代謝外源性和內(nèi)源性化學(xué)物質(zhì)的重要酶系,與人體健康和疾病有著密切的關(guān)系[5],國(guó)外已經(jīng)有研究顯示GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性和男性特發(fā)性不育癥有密切聯(lián)系[6]。GSTs分布較廣,幾乎廣泛存在于人體所有的細(xì)胞和組織,尤其在生殖腺中表達(dá)較高,許多外源性誘導(dǎo)劑或損傷性刺激均可引起細(xì)胞內(nèi)GSTs異常表達(dá)[7]。由于GSTs同工酶亞型種類(lèi)的多樣化,所以分類(lèi)也較復(fù)雜,目前研究最多的是GSTT1和GSTM1基因多態(tài),因?yàn)檫@兩個(gè)基因都存在純合性缺失這一多態(tài)現(xiàn)象[8],GSTM1和GSTT1基因缺失可導(dǎo)致相應(yīng)酶活性降低或無(wú)結(jié)合活性。

本研究發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性進(jìn)行比較,實(shí)驗(yàn)組GSTM1基因及GSTM1+GSTT1組合的缺失型基因均高于對(duì)照組(58.7%∶33.3%,45.3%∶19.4%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),說(shuō)明GSTM1與壯族人群少精癥患者有著密切的聯(lián)系。需要強(qiáng)調(diào)的是與男性不育的相關(guān)基因很多,而且這些基因并不是單獨(dú)起作用的,而是與其他基因一起對(duì)男性生殖系統(tǒng)發(fā)揮作用,有研究顯示:組合基因缺失對(duì)DNA的生物學(xué)影響比單個(gè)的基因變異大[5],因此在研究男性不育相關(guān)基因時(shí),我們也應(yīng)該著眼于多基因研究。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出,GSTT1基因在兩組間的比較并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.56),但是GSTT1+GSTM1基因組合其缺失型在壯族人群少精癥患者中出現(xiàn)頻率卻較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),說(shuō)明GSTT1和GSTM1一起,與壯族人群少精癥患者可能也有一定的關(guān)系。正常人受到有毒化學(xué)物質(zhì)的刺激后,GSTM1和GSTT1表達(dá)增高,起到解毒作用,以免細(xì)胞受損。正是由于GSTM1和GSTT1在體內(nèi)物質(zhì)代謝中有很重要的作用,當(dāng)GSTM1和GSTT1基因發(fā)生突變或缺失時(shí),體內(nèi)的有毒物質(zhì)代謝將受影響,與生殖系統(tǒng)相關(guān)的一些有毒物質(zhì)將得不到及時(shí)的降解和排出,在體內(nèi)蓄積到一定程度后即可通過(guò)氧化應(yīng)激等作用危害男性生殖器官的功能,影響生精過(guò)程,使精子數(shù)目下降、畸形率上升、精子活動(dòng)力下降、卵子受精率下降等,從而引起不育。GST在人群中存在遺傳多態(tài)性,多態(tài)性包括基因的完全或部分缺失,可以導(dǎo)致GSTT1及GSTM1蛋白的酶活性丟失。這種多態(tài)性與人體對(duì)環(huán)境中毒性物質(zhì)的解毒能力相關(guān),從而影響到個(gè)體對(duì)疾病的易感性,影響精子的成熟和精液的質(zhì)量。這一點(diǎn)可因不同的種族、地域而存在相應(yīng)的差異[9]。

精液主要由精子和精漿兩部分組成。研究發(fā)現(xiàn),精液中的代謝產(chǎn)物如氧自由基、二氧化碳、組胺等會(huì)影響到精子的成熟及運(yùn)動(dòng)[10]。而GSTM1和GSTT1則是參與代謝外源性和內(nèi)源性化學(xué)物質(zhì)的重要酶系,當(dāng)其缺乏時(shí),精液中的代謝物的轉(zhuǎn)化將受影響,氧化過(guò)程中對(duì)機(jī)體有害的產(chǎn)物聚集,從而影響到精子的成熟與質(zhì)量。大量的研究表明[11],精液內(nèi)存在大量有毒代謝產(chǎn)物可以使睪丸的精子發(fā)生減退,引起精子凝集。其活性產(chǎn)物(蛋白酶、細(xì)胞因子等)通過(guò)精子膜過(guò)氧化等機(jī)制對(duì)精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能造成損害而影響生育力,例如畸形精子比例增加、尖頭精子和尾部畸形精子顯著增加等。

由本研究結(jié)果可以看出:精細(xì)胞GSTM1基因和GSTT1+GSTM1基因多態(tài)性與壯族男性少精癥有著較為密切的聯(lián)系。但由于人類(lèi)生殖的復(fù)雜性,盡管對(duì)男性不育的研究已經(jīng)有了大量的臨床和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)的積累,人類(lèi)對(duì)自身生殖的了解仍然非常有限,人類(lèi)生殖還有很多未解之謎。相信隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展,很多謎底都將被揭開(kāi),特別是隨著人類(lèi)基因組測(cè)序的完成和功能基因組計(jì)劃的開(kāi)展,為研究男性不育的基因機(jī)制及它對(duì)睪丸、附睪功能的影響提供了條件,男性不育的機(jī)制和診治終將會(huì)得到解決。

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