waaF空腸彎曲菌變異株神經節苷脂表位的改變①

束曉梅 王曉紅 彭 昌 (遵義醫學院附屬醫院兒科,遵義 563003)

空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni,CJ)感染與自身免疫性周圍神經病——Guillain-Barre綜合征(GBS)關系密切,但機制不清[1]。CJ的脂寡糖(lipooligosaccharide,LOS)結構上存在多種神經節苷脂樣結構,可能通過分子模擬發生周圍神經免疫性損傷。waaF基因編碼庚糖轉移酶,催化轉移庚糖連接到LOS外核上。理論上說,waaF基因敲除后,變異株丟失LOS上所有的神經節苷脂表位[2],即 waaF變異株不含有模擬神經節苷脂樣結構,不能誘導動物產生神經節苷脂抗體及免疫性周圍神經損傷。我們用Benjamin博士饋贈的 waaF基因敲除變異株,對照親代株研究兩者誘導動物抗體產生及周圍神經損傷的改變,對進一步證實 CJ誘發GBS的分子模擬理論及探索waaF變異株作為減毒活菌苗的可能性具有十分重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 CJ親代株(菌號HB9313,血清型HS:19)及其waaF變異株由澳大利亞皇家墨爾本研究所Benjamin N Fry博士饋贈。神經節苷脂GM1、GD1a、GD1b、GD3、GT1b 及辣根過氧化物酶標記的IgG抗體購自Sigma公司,親代株(HB9313)的LOS由本實驗室純化,經SDS-PAGE鑒定純度達到95%。3月齡日本大耳兔由重慶醫科大學動物中心提供,體重2～2.5千克,雌雄不限。

1.2 方法

1.2.1 滅活CJ菌液制備 兩菌株均微需氧環境,42℃生長于Skirrow培養基中,變異株需加入終濃度為0.03 μ g/L的卡那霉素。用含甲醛0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)滅活,3 500 r/min離心30分鐘,9 g/L鹽水洗滌沉淀物2次,3 500 r/min室溫離心10分鐘,棄上清液,調至終濃度為3×1012CFU/L的滅活菌液備用。

1.2.2 實驗動物分組 日本大耳兔26只,隨機分為3個實驗組:親代株組(10只)、waaF變異株組(10只)及對照組(6只)。

1.2.3 免疫方法 初次免疫:取完全弗氏佐劑分別與等體積的親代株菌液、變異株菌液、9 g/L鹽水溶液混勻充分乳化后,以每只兔總量2 ml,背部皮下多點注射;加強免疫:分別在初次免疫后2周、3周時,取不完全弗氏佐劑與等體積的上述菌液混合,按每只兔總量1 ml,背部皮下多點注射。

1.2.4 血清LOS-IgG及多種神經節苷脂IgG抗體檢測 各組動物分別于初次免疫后2周、4周經耳緣靜脈取血2 ml,分離血清,-70℃低溫冰箱保存備用,采用 ELISA方法檢測血清中特異性抗 LOS-、GM1-、GD1a-、GD1b-、GD3-、GT1b-IgG 抗體。純化的LOS用新鮮配制的包被液稀釋成50 μ g/ml,包被酶標板,100 μ l/孔 ;神經節苷脂GM1、GD1a、GD1b、GD3及GT1b 稀釋成 2 μ g/ml,每孔 100 μ l包被,4℃過夜 ,10 g/L血清白蛋白(BSA)封閉,37℃濕盒孵育2小時;1∶50稀釋血清樣本每孔100 μ l,設復孔,37℃孵育2小時,磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗3次;加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG抗體,37℃孵育1小時;PBST洗3次;四甲基聯苯胺(TMB)避光顯色15分鐘,硫酸終止反應;設包被液作空白對照,封閉液作陰性對照,490 nm波長下讀取光密度值(OD 490)。

1.3 統計學處理 SPSS 10.0統計軟件包進行統計處理,數據以±s表示,均數間比較用t檢驗,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

免疫前及免疫后不同時間血清LOS-IgG及多種神經節苷脂IgG抗體水平見表1。①無論使用親代株還是waaF變異株全菌抗原,經全身免疫后兩組動物血清均顯示抗LOS-IgG抗體滴度增高。免疫后14天,親代株及waaF變異株動物LOS-IgG抗體水平為(0.758±0.136及0.744±0.125),較免疫前(0.250±0.101及0.226±0.083)相比明顯增高(P＜0.05),4周進一步增高為(0.971±0.214及0.975±0.172),為免疫前的4倍以上,親代株及waaF變異株兩組間抗體水平無明顯差異(P＞0.05),而對照組免疫前后LOS-IgG抗體水平無明顯改變。②接受親代株免疫的兔子,2周時血清抗GM1-IgG、GD1a-IgG及GT1b-IgG抗體水平分別為(0.661±0.290、0.487±0.041及0.457±0.071)與免疫前(0.173±0.081、0.151±0.038及0.182±0.101)相比明顯增高(P＜0.05),4周時進一步增高為(0.984±0.025、0.541±0.178及0.574±0.156)。而接受waaF變異株免疫的動物及對照組免疫后始終未見任何神經節苷脂抗體的增高。

表1 免疫后不同時點血清IgG抗體水平的變化(OD490,±s)Tab.1 Serum IgG titers at different time points after immunization(OD490,±s)

表1 免疫后不同時點血清IgG抗體水平的變化(OD490,±s)Tab.1 Serum IgG titers at different time points after immunization(OD490,±s)

Note:1)P＜0.05,compared with that before immunization.

Groups IgG antibody titers GM1 GD1a GD1b GD3 GT1b LOS Parental strain(n=10)0 day 0.173±0.081 0.151±0.038 0.170±0.109 0.176±0.045 0.182±0.101 0.250±0.101 14 day 0.661±0.2901) 0.487±0.0411) 0.180±0.126 0.157±0.051 0.457±0.0711) 0.758±0.1361)28 day 0.984±0.0251) 0.541±0.1781) 0.157±0.108 0.173±0.089 0.574±0.1561) 0.971±0.2141)waaF mutant(n=10)0 day 0.170±0.085 0.157±0.112 0.187±0.088 0.163±0.101 0.196±0.098 0.226±0.083 14 day 0.193±0.078 0.174±0.077 0.167±0.111 0.163±0.098 0.189±0.124 0.744±0.1251)28 day 0.180±0.063 0.147±0.108 0.163±0.056 0.157±0.076 0.177±0.098 0.975±0.1721)Control(n=6)0 day 0.163±0.056 0.159±0.167 0.189±0.176 0.144±0.065 0.153±0.043 0.203±0.065 14 day 0.178±0.060 0.217±0.181 0.168±0.076 0.193±0.234 0.212±0.167 0.275±0.078 28 day 0.171±0.082 0.189±0.045 0.134±0.023 0.134±0.034 0.215±0.078 0.243±0.087

3 討論

CJ是引起急性胃腸炎最常見的細菌之一,更重要的是該菌與常見的免疫性周圍神經病GBS密切相關。大量流行病學及臨床血清學資料顯示,GBS常有CJ前驅感染史,GBS患者血清中含CJ的LOS抗體和多種抗神經節苷脂抗體 ,抗GM1、GD1a、GD1b、GD3 及GT1b抗體與GBS的關系引起廣泛重視[3-5]。

CJ誘導GBS的確切機制尚不明確。目前,多數學者接受的分子模擬理論認為,可能由于 CJ外膜上的LOS存在神經節苷脂樣結構,通過交叉免疫導致周圍神經損傷[1]。LOS類似脂多糖結構,LOS又分內核及外核,外核上存在多種神經節苷脂樣表位(ganglioside-like epitopes)。理論上說,若敲除LOS外核糖基合成的基因,則LOS不再含有任何神經節苷脂模擬結構,不再能誘導動物周圍神經免疫損傷,如此,便可在基因水平驗證分子模擬理論,同時也可解決因神經節苷脂模擬結構的存在,制約CJ菌苗安全性的問題。

本實驗對照親代株及waaF變異株免疫的結果顯示,CJ親代株確實含有多種神經節苷脂樣結構,可刺激動物產生相應多種神經節苷脂抗體,而waaF變異株免疫的動物未見任何神經節苷脂抗體的增高,此結果從基因水平支持CJ誘導GBS發病的分子模擬理論學說。另一方面,waaF變異株雖丟失神經節苷脂表位,但其LOS結構仍具有免疫原性,仍可誘導LOS抗體產生,可能成為無神經免疫毒性的CJ菌苗候選株。

1 Willison H J,Yuki N.Peripheral neuropathies and anti-glycolipid antibodies[J].Brain,2002;125(12):2591-2625.

2 Phongsisay V,Perera V N,Fry B N.Exchange of lipooligosaccharide synthesis genes creates potential Guillain-Barre syndrome-inducible strains of Campylobacter jejuni[J].Infect Immun,2006;74(2):1368-1372.

3 Kusunoki S,Kaida K,Ueda M.Antibodies against gangliosides and ganglioside complexes in Guillain-Barré syndrome:New aspects of research[J].Biochim Biophys Acta,2008;1780(3):441-444.

4 Hamaguchi T,Sakajiri K,Sakai K et al.Guillain-Barré syndrome with antibodies to GD1a/GD1b complex[J].J Neurol Neurosurg Psychiatry,2007;78(5):548-549.

5 Kaida K,Morita D,Kanzaki M et al.Anti-ganglioside complex antibodies associated with severe disability in GBS[J].J Neuroimmunol,2007;182(1-2):212-218.