人β淀粉樣蛋白1-42在大腸桿菌中的表達純化及鑒定*

熊坤林,楊清武,熊任平

(第三軍醫大學大坪醫院:1.放射科;2.神經內科;3.野戰外科研究所第六研究室,重慶400042)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是發生于老年和老年前期的中樞神經系統變性疾病,臨床上表現為隱襲起病、進行性發展的記憶減退、認知、語言障礙及人格改變等。其特征性病理學改變是大腦皮層和皮層下結構細胞內神經元纖維纏結(neuofibrillary tangle,NFT)、細胞外大量老年斑(senile plaque,SP)形成及神經元缺失等[1-3]。其已成為繼心臟病、癌癥和中風之后第4位死因。神經毒性β淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)在腦內的聚集和異常沉積是AD發病的關鍵環節。AD醫學影像學診斷尚無突破性進展,為研制一種敏感且具有高血腦屏障的分子特異性探針——腐胺-釓-β淀粉樣蛋白(putrescine-Gadolinium-amylor-β peptide,PUT-GD-Aβ),該 分子探針既可特異性標記AD的 β淀粉樣斑塊(β-amyloid plaques),也因為金屬釓而產生M RI下可見的對比增強,可用于AD的影像診斷和鑒別診斷[4]。本研究擬在大腸桿菌中高效表達并純化人源性β淀粉樣蛋白 1-42(Aβ1-42),為該標記探針的制備提供物質基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌株 表達質粒pET-28a(+)購自美國Novagen公司,大腸埃希菌BL21(DE3)株由本室保存。

1.2 主要試劑及引物合成、測序 高保真KOD-plus Taq酶、限制性內切酶 NcoⅠ、Bam HⅠ、Mag Extractor-His-tag Fusion Protein Purification Kit試劑盒購自日本Toyobo公司,T4 DNA連接酶購自上海生物工程公司,DNA Marker及蛋白Marker購自北京鼎國生物公司,PVDF膜購自美國Roche公司,Aβ1-42蛋白單克隆抗體6E10(針對Aβ1-17)購自美國Calbiochem公司,熒光標記羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋公司,DNA片段和引物合成及DNA測序由上海生工提供服務。

1.3 人源性Aβ1-42蛋白編碼區 DNA片段的獲取 Aβ1-42蛋白為酶降解的β淀粉樣前體蛋白(homo sapiens amyloid precursor protein,APP)的616-657位氨基酸序列。根據該段蛋白的編碼區序列(Gen Bank中的登錄號為NM_001136130)設計3條DNA片段,經退火延伸后形成Aβ1-42蛋白的編碼雙鏈DNA 序列。 片段1:5′-gat gca gaa ttc cga cat gac tca gga tat gaa gtt cat cat caa aaa tt-3′(正鏈),片段 2:5′-cct ttg ttt gaa ccc aca tct tct gca aag aac acc aat ttt tga tga tga act-3′(負鏈),片段3:5′-cgc tat gac aac acc gcc cac cat gag tcc aat gat tgc acc ttt gtt tga acc cac-3′(負鏈),3條DNA片段的退火反應體系為片段 1、2、3(10mmol/L TE 溶解,終濃度為 10μ mol/L)各8μ L,10×PCR Buffer 2.5μ L,MgCl22.0μ L,dN TPs 2.0μ L,KOD-plus Taq酶 1.0μ L,ddH2O 18.5μ L。熱循環參數為 94℃、2min;(94℃、20s,55℃、20s,72℃、30s)×20循環;72℃、3min。所獲產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的片段,稀釋后用作下一步PCR模板,擴增獲得目的片段。擴增引物為上游引物:5′-tat acc atg gat gca gaa ttc cga cat ga-3′(下劃線部分為 NcoⅠ位點,加黑部分為起始密碼),下游引物:5′-ttc gga tcctta cgc tat gac aac acc gcc-3′(下劃線部分為Bam HI位點,加黑部分為終止密碼)。PCR反應體系(25.0μ L)為退火的模板 DNA回收物(1∶100稀釋)1.0μ L,10×PCR Buffer 2.5μ L,M gCl22.0 μ L,dNTPs 2.0μ L,KOD-plus Taq 酶 0.2μ L,上游引物(10μ M)1.0μ L,下游引物(10μ M)1.0μ L,ddH2O 15.3μ L 。 熱循環參數為 94℃、2min;(94℃、20s,55℃、20s,72℃、30s)×32 循環;72℃、3min。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳,回收目的片段,作下一步的酶切和連接反應。

1.4 重組質粒pET-28a-Aβ1-42的構建

1.4.1 NcoⅠ/Bam HⅠ雙酶切反應 將上一步驟中所回收純化Aβ 1-42的 PCR產物和 pET-28a(+)質粒作 NcoⅠ/Bam HⅠ雙酶切反應,反應體系見表1。置 37℃、3h反應。酶切產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳,回收目的片段,作下一步的連接反應。

表1 NcoⅠ/Bam HⅠ雙酶切反應體系(μ L)

1.4.2 連接反應 反應體系為pET-28a(+)/NcoⅠ、Bam HⅠ雙酶切產物(約 1μ g/μ L)3.0μ L,Aβ1-42/Nco Ⅰ 、Bam H Ⅰ雙酶切產物(約 1μ g/μ L)2.0μ L,Ligation high 反應液 5.0μ L,總體系10.0μ L。置 16℃、1h反應。連接產物直接轉化大腸埃希菌BL21感受態。

1.5 Aβ1-42蛋白在大腸桿菌中的表達 用常規CaCl2法制備BL21感受態。取10μ L上一步驟的連接產物常規轉化到100μ L BL21感受態細胞中,將轉化產物與IPTG和X-gal涂布于LB(Kanr)平板上,37℃過夜孵育。挑選陽性克隆,提取重組質粒。陽性重組質粒 pET-28a(+)-Aβ1-42作 NcoⅠ/Bam HⅠ雙酶切鑒定后,再作DNA測序鑒定。挑選重組質粒序列完全正確的陽性重組菌,于 Kanr的LB液體中,37℃、160rpm離心,培養至菌液OD600達0.6～0.8時,加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導表達 6h,培養物離心,沉淀用 SDSPAGE上樣緩沖液裂解,作 15%T ricine-SDS-PAGE電泳,凝膠掃描成像。對照菌為不含插入基因的質粒pET-28a(+)轉化BL21菌。

1.6 重組蛋白表達形式的鑒定 收集誘導表達后菌體,PBS混懸,超聲破菌,15 000g離心10min,分別收集上清液和沉淀。裂菌液上清液及沉淀溶解液取樣進行SDS-PAGE電泳分析。

1.7 重組表達蛋白的純化 表達蛋白的C-端含6×His標簽,故采用日本 Toyobo生物公司的MagExtractor-His-tag Fusion Protein Purification Kit試劑盒進行純化。參照試劑盒說明書中可溶性蛋白和包涵體不溶性蛋白的純化方法分別進行。所獲產物作15%T ricine-SDS-PAGE電泳。

1.8 表達蛋白的Western blot鑒定 純化蛋白作SDS-PAGE電泳后,轉印PVDF膜,按照參考文獻[5]的方法進行。一抗和二抗的結合和反應參照試劑說明書進行。

2 結 果

2.1 Aβ1-42蛋白編碼片段的獲得 通過3個合成單鏈DNA片段的退火,獲得126bp的 Aβ1-42蛋白編碼序列,進一步經PCR擴增,獲得兩端分別含NcoⅠ、Bam HⅠ酶切位點的DNA片段,同時加入起始密碼和終止密碼,瓊脂糖凝膠電泳見圖1。

圖1 Aβ1-42蛋白編碼片段 PCR產物電泳圖

圖2 重組質粒pET28a(+)-Aβ1-42經NcoⅠ/Bam HⅠ雙酶切后電泳圖

2.2 pET28 a(+)-Aβ1-42重組質粒雙酶切及核苷酸測序鑒定 將Aβ 1-42蛋白編碼序列片段PCR產物作NcoⅠ/Bam HⅠ雙酶切后回收純化,與經同樣雙酶切的pET28a(+)質粒回收產物連接,連接產物轉化BL21(DE3)細菌感受態細胞,挑取轉化平板上的單個菌落,提取重組質粒pET28a(+)-Aβ1-42,采用NcoⅠ/Bam HⅠ雙酶切鑒定,酶切產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳,見圖2。重組質粒中可切出預期大小的片段(Aβ1-42蛋白編碼序列理論值約為130bp)。進一步對重組質粒進行DNA測序,結果表明,重組質粒的序列和閱讀框均完全正確。測序結果見插頁Ⅰ彩圖3。

2.3 pET28(a)-Aβ1-42表達形式的判定及表達蛋白的純化將篩選到的陽性pET28(a)-Aβ1-42工程菌加入IPTG誘導表達,SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白表達情況。可見明顯的約4.5×103表達蛋白條帶,與理論預期值相符。進一步采用MagExtractor-His-tag Fusion Protein Purification Kit進行純化后得到高純度目的蛋白,經凝膠電泳后掃描,其純度為55%,為進一步的GST純化和 Thrombin切出成熟的 Aβ1-42表達蛋白提供了基礎,見圖3。

圖3 exCAR表達蛋白的純化結果

2.5 純化表達蛋白的Western blot鑒定 純化表達蛋白的Western blot結果見圖4。在約6×103位置出現明顯特異性陽性條帶,說明表達蛋白確為人源性Aβ1-42蛋白。

圖4 純化表達蛋白的Western blot鑒定

3 討 論

AD是引起癡呆最常見的疾病之一,大概占癡呆病因的50%～60%,在西方發達國家AD在60～64歲年齡組的發病率不到1%,但在85歲及其以上的人群中發病率呈指數級增長(24%～33%);在發展中國家AD的發病率有所降低,但卻有60%AD患者是分布在發展中國家的,目前AD成為威脅公眾健康的主要疾病,2001年全世界AD患者2 400萬,隨著人類壽命的延長,到2040年估計將有8 100萬AD患者[1-2]。其已成為繼心臟病、癌癥和中風之后第4位死因。

AD的診斷除常規行為學檢查外,輔助診斷方法有神經心理學檢查、生化指標檢查、電生理學檢查、神經影像學檢查等,而其中神經影像學檢查對病情和病程的判斷和預后最為直接和重要[6]。由于診斷和鑒別診斷困難,醫學影像學的AD研究很受限制,目前臨床上對于AD的影像學診斷多停留在腦容量測量(估計腦萎縮程度)或通過MR頻譜分析成像(M RS)對物質新陳代謝率及葡萄糖代謝等間接檢測水平上[7-8]。近年來隨著分子影像學的發展及MR儀器分辨率的不斷提高,特別是MR顯微成像技術的發展,為AD的明確診斷及病變過程的追蹤及定量監測、治療效果的評判開辟了一條嶄新的道路。

本研究擬研制一種敏感的分子特異性探針(PUT-GDAβ),其可以特異性標記AD的β淀粉樣斑塊并因為其與金屬釓的連接而產生M RI下可見的對比增強,其研究進展將對未來AD的診斷及治療產生直接深刻的影響[4]。首先,該標記法可用于AD疾病的早期發現和明確診斷;其次,可用于對疾病的發展過程進行追蹤,并且對于常用的抑制Aβ生成或減少淀粉負擔的治療措施的療效進行定量監測評價。這種方法可以解決以往療效評估無明確定量指標、療效觀察所需時間長(往往需要幾個月)等難題。

Aβ是一系列含39～43個氨基酸的肽,為 APP的水解產物。APP在β分泌酶作用下生成APP-C99,后者在γ分泌酶復合體作用下形成長度不等的 Aβ片段,包括 Aβ 42、Aβ43和Aβ40[9]。人Aβ1-42蛋白為酶降解的APP的616～657位氨基酸序列,其全部氨基酸序列為 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA。理論相對分子質量約為4.5×103,人源性β淀粉樣A4前體蛋白序列在GenBank中的登錄號為NM_001136130。通常在研究工作中,往往采用多肽合成的方法獲得Aβ 1-42肽,但這種方法仍存在一些問題,如價格昂貴、難以保存為 Aβ 1-42單體形式、Aβ1-42在多肽合成儀上屬于難合成肽等。因此,本研究采用大腸桿菌表達,通過3條DNA片段合成獲得 Aβ 1-42蛋白編碼區片段,連接至表達質粒pET28a(+)中,在大腸桿菌BL21株中獲得了表達,并通過純化蛋白的Western blot進一步鑒定了該表達蛋白,但該蛋白的表達形式為包涵體。

通常來說,絕大多數外源性蛋白在大腸桿菌中會形成包涵體,其形成的原因還不甚明了,但是普遍認為是由于重組蛋白在宿主菌中表達時,缺乏某些蛋白質折疊過程中所需要的酶或分子伴侶等,所以無法形成正確的次級鍵等原因造成的。當外源蛋白表達量過高、重組蛋白含硫氨基酸過高、重組蛋白的等電點與胞內pH接近及重組蛋白為異源性蛋白時,更容易形成包涵體[10]。本研究曾采用一些措施,一是降低誘導劑濃度,如將IPTG終濃度降至0.1mmol/L;二是降低誘導時工程菌的培養溫度,如在25℃條件下進行誘導,以降低工程菌合成外源性蛋白的速度,以期獲得可溶性的表達蛋白,但均未成功。這可能與表達蛋白的特性有關[5]。由于pET表達系統的宿主細胞為改造后λ噬菌體CE6感染的大腸桿菌BL21溶源菌株,該菌株的基因組中整合有laco調控的T7 RNA聚合酶基因,這種嚴格的雙重調控可以確保表達載體中目的基因的嚴格誘導性表達,有效避免目的蛋白質對宿主細胞的毒性作用而引起的質粒不穩定性[11]。

本研究所獲得的基因工程化Aβ1-42蛋白,N-端含載體序列編碼的6×His和GST標簽,采用鎳株法一步純化,獲得的蛋白分子質量約為6×103,與理論相對分子質量相符。本研究為下一步采用GST標簽純化和 Thrombin切出4.5×103的Aβ1-42蛋白及PUT-GD-Aβ的制備提供了物質基礎。

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