76例食管胃交界腺癌腫瘤相關成纖維細胞免疫組化觀察*

周海英,吳愛萍,劉 巖,陳銀蘋,鄭素琴,王文雅

(1.河北醫科大學附屬唐山工人醫院胸外科;2.華北煤炭醫學院病理教研室,唐山;3.華北煤炭醫學院流行病學與衛生統計學教研室,唐山063000)

侵襲和轉移是惡性腫瘤最為明顯的生物學特性,既與腫瘤細胞自身特性相關,亦受臨近腫瘤宿主成分的影響,因此,有學者提出了腫瘤-宿主界面微環境這一概念,即變異上皮與其臨近間質所構成的微生態環境[1]。腫瘤相關成纖維細胞(tumorassociated fibroblasts,TAFs)是此界面體系中最重要的宿主細胞之一,其所分泌的成纖維細胞活化蛋白(FAP)、肝細胞生長因子(HGF)等在惡性腫瘤發生、發展中起重要作用[2]。食管胃交界腺癌是指橫跨食管和胃交界的腺癌,過去多籠統稱為胃賁門腺癌。但無論從病理上還是臨床特征上,賁門癌均與遠端胃癌有明顯的不同,卻與食管遠端腺癌有許多相似之處,因此,學術界都傾向將食管胃交界腺癌列為一獨立類型的腫瘤,并按食管癌TNM分期標準進行分期[3-4]。本課題通過研究FAP、HGF的表達,分析食管胃交界腺癌中 TAFs及其與臨床病理參數的關系。

1 臨床資料

1.1 一般資料與標本采集 選擇本院2006～2009年原發性食管胃交界腺癌手術切除患者標本76例,其中男51例,女25例;年齡40～76歲,中位 59歲。所有患者術前均未經化療和放療。另通過胃潰瘍行胃大部切除術獲取正常胃黏膜標本6例,慢性萎縮性胃炎胃黏膜標本6例。

1.2 實驗方法

1.2.1 手術標本行常規甲醛固定,24h內取材,石蠟包埋后行4μ m厚連續切片,分別進行常規HE染色和免疫組化染色(SP法)。

1.2.2 免疫組化試劑為鼠抗人FAP單克隆抗體(Alexis公司)、鼠抗人波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體(ZYMED公司)、鼠抗人HGF單克隆抗體(Alexis公司)、免疫組化即用型SP試劑盒(福建邁新生物技術開發公司)等。免疫組化染色過程參照試劑盒說明書操作。

1.2.3 以分別表達FAP、HGF、Vimentin的乳腺癌標本為各自陽性對照;以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.4 由2位資深病理醫師獨立觀察每張切片。結合陽性片中典型陽性細胞的著色特征并排除邊緣效應、刀痕等非特異性染色干擾因素的影響,將胞膜、胞漿中出現棕黃色著色的細胞判定為FAP/HGF陽性顯色細胞;將胞漿中出現棕黃色顆粒的細胞判定為Vimentin陽性顯色細胞。結合細胞形態、位置進行分析,判定Vimentin陽性顯色細胞為成纖維細胞,Vimentin與FAP同時陽性者為TAF。FAP、HGF根據陽性細胞染色程度及染色細胞百分率進行評分。選擇10個典型視野(×400),每個視野內隨機計數50個成纖維細胞,共500個,陽性細胞百分率用分值表示,不表達為0分,＜10%為1分,10%～50%為2分,＞50%為3分;基本不著色者為0分,著色淡者為1分,著色深者為2分;每個視野內著色程度得分與著色細胞百分率得分相乘為該視野的最后得分,每張片子10個視野的平均分值為該標本的最后染色分值。參照Hasebe等[5]和鄭華等[6]的標準,將最后平均染色分值小于1者記為染色陰性標本,＞1者記為染色陽性標本。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件包進行分析。食管胃交界腺癌組與對照組、食管胃交界腺癌組各病理分級之間FAP(HGF)染色分值比較采用秩和檢驗;FAP、HGF染色陽性標本百分率比較采用卡方檢驗;FAP、HGF染色分值與食管胃交界腺癌病理分級是否相關采用Spearman′s分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 正常胃黏膜及慢性萎縮性胃炎組 黏膜上皮和間質組織內均未見FAP或HGF陽性細胞,在間質中可見較多Vimentin陽性細胞,尤其是在遠離上皮的間質中。

2.2 食管胃交界腺癌組 在間質中可見FAP、HGF陽性細胞,且染色陽性標本數目與腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移數目等呈正相關,且各組間陽性標本數比較,差異有統計學意義。FAP、HGF兩者之間呈正相關,其有效度及信度差異無統計學意義(表1)。

表1 食管胃交界腺癌中FAP、HGF的表達(n)

3 討 論

TAFs是腫瘤-宿主界面體系中最重要的宿主細胞,表達多種細胞因子、蛋白酶、黏附分子等,與腫瘤細胞相互作用,不同程度增加腫瘤細胞的惡性表型,對腫瘤發生、生長、血管形成、浸潤與轉移有重要作用,并具有器官特異性。

FAP是TAFs的標志性產物之一,屬于絲氨酸蛋白酶類,其選擇性表達于上皮性腫瘤間質及傷口愈合處,具有分解明膠和Ⅰ型膠原的活性以及類似二肽基肽酶的活性[7]。FAP主要通過下列方式對腫瘤-宿主界面微環境中各組成成分產生影響:(1)通過直接溶解與其相鄰的細胞外基質或激活另外一種蛋白酶而間接溶解基質,促進癌細胞的侵襲,并參與基質的重建;(2)解離與基質蛋白結合的生長因子,使之發揮促癌細胞生長的作用;(3)促進腫瘤微血管生成,從而有利于癌細胞的生長、侵襲[8-9]。

HGF是TAFs分泌的一種血源性生長因子,是近年來研究較多的調節腫瘤細胞浸潤、轉移的關鍵細胞因子。在促進細胞分裂、增殖、分化、運動及形態發生、血管生成、抑制腫瘤細胞凋亡等方面發揮重要的生物學功能[10]。HGF在腫瘤侵襲、轉移中的作用機制包括以下幾個方面:(1)促進腫瘤細胞遷移,增加瘤細胞侵襲性[11];(2)誘發血管生成,HGF可通過磷脂酰肌醇3激酶通路誘導血管內皮生長因子的分泌和表達,從而間接促進血管生成[12];(3)促進細胞增殖。

本實驗通過對FAP、HGF染色陽性細胞的形態、位置進行分析,初步確定其屬于成纖維細胞類型。為進一步明確細胞類型,本實驗同時進行了波形蛋白的免疫組化染色,結果顯示,對應于FAP陽性染色的細胞區域,波形蛋白的表達也呈陽性,說明其屬于成纖維細胞類型。免疫組化結果顯示,FAP及HGF在無病變胃黏膜、慢性萎縮性胃炎間質中不表達,在食管胃交界腺癌間質中表達陽性,提示FAP及HGF可作為判定胃黏膜良惡性病變的指標之一。另外在食管胃交界腺癌中,FAP、HGF染色陽性標本數目與腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移數目等呈正相關,提示 FAP、HGF的表達與食管胃交界腺癌的惡性程度及侵襲程度有密切關系,FAP及HGF表達明顯則腫瘤向深度侵襲的可能性加大,淋巴結轉移的可能性加大。隨著癌細胞的不斷浸潤擴展,間質中更多的成纖維細胞轉化為TAFs,分泌更多的FAP及HGF發揮生物學效應,造成癌細胞進一步侵襲、轉移。抑制FAP及HGF的活性可能抑制腫瘤的侵襲和轉移。

綜上所述,食管胃交界腺癌中TAFs的FAP、HGF表達增加,且與腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移數目等臨床病理參數相關。因此,推測TAFs可能通過其分泌的各種蛋白及生長因子等,對食管胃交界腺癌的浸潤、轉移等起著較重要的作用。

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