河北唐山漢族人群VDR和MBP基因交互作用與肺結核發病的相關性*

馮福民,郝金奇,陳 怡,孫淑豐,鄭國穎,陳 剛

(華北煤炭醫學院:1.流行病與衛生統計學科,河北省煤礦衛生與安全重點實驗室;2.護理學系中心實驗室,河北唐山063000)

遺傳學研究表明肺結核發病是多基因與環境因素共同作用的結果。國內外學者分別對 NRAM P1[1]、VDR[2]、MBP[3]、HLA[4]等基因的多態性與人群肺結核病發病的相關性進行了研究,但是,現有研究主要考察了單個基因與肺結核病易感性的關系,存在較大的局限性,基因與基因之間可能存在的交互作用尚未得到有效論證。尤其是對于復雜性狀的慢性病,基因和環境因素的交互作用在其中扮演著十分重要的“角色”認識不清。本研究在分別探討VDR基因和MBP基因與人群肺結核發病的基礎上,著重分析兩個基因在肺結核發生中是否存在交互作用及其作用方向和大小。

1 對象與方法

1.1 研究對象 病例組182例來自2006年8月至2007年12月經唐山市結核病醫院確診的漢族成年新發肺結核患者。全部病例按照1998年修訂的《中國結核病分類法》標準診斷,年齡大于或等于18歲;除外慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺癌、塵肺、肺炎、糖尿病、長期使用腎上腺皮質激素及其他免疫抑制劑、HIV感染等免疫功能低下者。對照組190例來自唐山市健康體檢中心,與病例同期的漢族成年健康體檢者。經PPD試驗確認有結核分支桿菌感染,年齡大于或等于18歲,與納入的病例或對照無血緣關系,排除標準與病例相同。

1.2 研究內容和方法

1.2.1 流行病學調查 按照文獻資料提供的信息及本研究的設計要求統一設計調查表,征得研究對象知情同意,現場詢問其一般情況,煙酒、衛生、飲食等生活習慣,家庭經濟、住房狀況,本人疾病史、結核患者接觸史、卡介苗接種史,家族結核病史等。

1.2.2 基因多態性分析 采集研究對象空腹靜脈血3 mL,EDTA抗凝。采用鹽析法提取人基因組DNA。根據參考文獻和基因庫中人類VDR和MBP基因序列特征,借助 primer premier5.0軟件設計PCR引物,送北京賽百盛基因技術有限公司合成,其基因位點和引物序列為:VDR TaqⅠ位點,454 bp,5′-caa cca aga cta ca agt acc gcg tca gtg 和 5′-ctg gaa gga gag gca gcg gta ctg;VDR Apa Ⅰ 位點,1 935 bp,5′-caa cca aga cta caa gta ccg cgt cag tg 和 5′-gag cac aag ggg cgt tag ctt cat g;VDR Fok Ⅰ 位點,267 bp,5′-agc tgg ccc tgg cac tga ctc tgg ctc和 5′-atg gaa aca cct tgc ttc ttc tcc ctc;MBP 52 位點,351 bp,5′-ggc ttc cca ggc aaa gat ggc(特異位點 C 引物)、5′-ggc ttc cca ggc aaa gat ggt(特異位點 T引物)和5′-tct tga acc tgg tgc cat ccc tac tg;MBP 54 位點,273 bp,5′-cag att gta gga cag agg gca tgc tc和 5′-tcc ccc ttt tct c(t)c ctt ggt gc(特異位點G 引物)、5′-tcc ccc ttt tct c(t)c ctt ggt gt(特異位點 A 引物);MBP 57 位點,285 bp,5′-cag att gta gga cag agg gca tgc tc 和 5′-cac gta cct ggt tcc ccc ttt tct c(特異位點 G 引物)、5′-cac gta cct ggt tcc ccc ttt tct t(特異位點A引物)。

表1 基因-基因交互作用的 Logistic回歸分析結果

VDR基因3個位點多態性采用PCR-RFLP方法分析,分別是TaqⅠ(TT型:454 bp;T t型:454 bp,293 bp,161 bp;tt型:293 bp,161 bp)、ApaⅠ(AA型:1 935 bp;Aa型:1 935 bp,1 647 bp,288 bp;aa型:1 647 bp,288 bp)和FokⅠ(FF型:267 bp;Ff型:267 bp,197 bp,69 bp;ff型:197 bp,69 bp)。M BP基因3個位點多態性分析采用特異引物法,利用各個位點特異性引物進行PCR擴增,單一特異引物擴增陽性者為純合子,兩個特異引物擴增均陽性者為雜合子,同時以P54上游引物和P52下游引物組合擴增的574 bp片段作為質控來證實PCR反應的有效性。

1.3 統計學方法 以Excel 2003建立數據庫,單因素、多因素、交互作用分析采用SPSS11.5軟件完成。使用雙側檢驗,檢驗水準α=0.05。基因型分布的Hardy-Weinberg遺傳平衡分析采用擬合優度χ2檢驗。

2 結 果

2.1 研究對象的基本特征及均衡性分析 病例組(男122例,女60例)和對照組(男132例,女58例)性別差異無統計學意義(χ2=0.256,P=0.613)。病例組(42.74±14.79)歲和對照組(45.86±16.26)歲年齡差異無統計學意義(t=1.931,P=0.054)。兩組研究對象的農村和城市居住地差異無統計學意義(χ2=2.137,P=0.154)。表明兩組人群性別、年齡、城鄉居住地均衡,具有可比性。對照組VDR和MBP基因型別的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果表明擬合優度優良(觀察值與期望值差別較小,χ2值介于 0.4～2.4之間,P＞0.05),說明對照人群處于平衡狀態,具有良好的代表性,可以從基因頻率來估計基因型頻率。

2.2 病例組和對照組一般情況的單因素分析 單因素分析結果顯示,肺結核患者接觸史(OR=7.423,95%CI:3.565～15.657)、肺結核家族史(OR=3.938,95%CI:1.956～7.926)、重體力勞動(OR=1.800,95%CI:1.010～3.208)為肺結核發生的危險因素,有卡介苗接種史(OR=0.632,95%CI:0.473～0.821)、有卡痕(OR=0.535,95%CI:0.384～0.856)為肺結核發生的保護因素。

2.3 VDR、MBP基因多態性與肺結核發生的關系 病例組中,TaqⅠ、ApaⅠ、FokⅠ、P52、P54位點的突變型純合子分別占0.0%、7.7%、31.9%、4.9%、0.5%,雜合子分別為占 8.2%、46.7%、37.4%、7.7%、12.6%;在對照組中,其突變型純合子分別占 1.0%、7.4%、30.0%、2.1%、1.1%,雜合子分別為占11.1%、41.6%、32.1%、3.7%、10.5%。在基因多態性位點與肺結核發病的單因素非條件Logistic回歸分析中,TaqⅠ、P52、P54的純合子突變率低,與雜合子型合并分析。P57位點突變率不足1%,未進行分析。以野生型為參照,未發現VDR基因 TaqⅠ、ApaⅠ、FokⅠ位點和MBP基因P54位點多態性在病例組和對照組的分布差異無統計學意義。僅P52位點的多態性與肺結核的發生有關(β=0.856,S.E=0.382,Wald χ2=5.011,P=0.025,OR=2.354,95%CI為:1.112～4.981)。多因素非條件 Logistic回歸分析結果顯示控制了上述5個變量的協同作用后,MBP基因P52位點多態性仍然與肺結核的發生有關(β=0.845,S.E=0.395,Wald χ2=4.582,P=0.032,OR=2.329,95%CI為:1.074～ 5.050),未發現VDR和其他MBP基因位點多態性與肺結核的發生相關。

為了探討VDR和MBP基因各位點基因型不同組合對肺結核發生危險性的影響分析,本文應用多因素Logistic回歸軟件對這5個基因位點的不同組合進行了交互作用分析,3個及以上位點的組合分析均未見交互作用,兩兩基因位點間的交互作用結果見表1,同時對有交互作用的位點進行叉生分析,結果見表2。

表2 VDR和M BP基因相關位點多態性的叉生分析

結果顯示,VDR基因FokⅠ與 ApaⅠ、FokⅠ與MBP基因P52位點多態性之間的交互作用有統計學意義,但是,兩個基因間3、4、5個位點多態性之間的交互作用無統計學意義。以FokⅠ野生基因型FF為參照,FokⅠ雜合子攜帶者與ApaⅠ雜合子之間表現為相乘作用,對ApaⅠ雜合子與結核病之間的聯系具有增強作用,危險性提高2.5倍。但P52基因Ct+tt與FokⅠ基因Ff之間的叉生分析沒有發現進一步的聯系。

3 討 論

VDR和MBP均是體內重要的細胞因子,活性水平在人群中分布不均[5],其基因多態性與機體的感染和炎癥有關[6]。而肺結核作為一種慢性感染性疾病,影響其發病的因素很多,但主要歸結為環境因素和遺傳因素2大類。本研究發現肺結核患者接觸史、卡介苗接種史、卡痕、重體力勞動、結核病家族史與肺結核的發病有關,與國內外相關研究結論大體一致。

在單一基因位點突變研究中僅發現P52位點突變基因型攜帶者發生肺結核的危險性高于野生型基因攜帶者,提示MBP基因突變可影響巨噬細胞吞噬結核桿菌的活性[7],導致宿主淋巴細胞對結核菌素的反應性下降[8]。但不同種族的基因型特征存在明顯的差異,在非洲[9]、印度[10-11]的研究就得出了3種截然相反的結論。本研究沒有發現唐山地區漢族人VDR基因的FokⅠ、ApaⅠ和TaqⅠ位點突變與肺結核的關聯,提示這些易感基因型單獨存在時并不能增加肺結核的患病風險。這與劉瑋等[12-13]在中國的漢族軍人和藏族人群中研究的結論不同;而與南非、西非、秘魯和居住在倫敦的印度人等地的研究結論一致[14-18]。

各研究結果之間的這種差異反映出結核病的易感性不是單一基因多態性所決定的,可能與地區、環境因素以及人種的不同相關聯,也可能與各獨立研究的樣本量較少有關。某個基因位點的變異對最終導致肺結核的發生影響有限,所以也不難理解VDR基因多態性與肺結核無關的結論。

肺結核的發生與發展是多因素介入涉及多個基因改變多步驟的過程,多種“易感”基因型同時存在可能大幅度增加或降低肺結核發生的危險性。單個細胞因子基因多態性的研究常常會有不一致的結果,或者沒有顯示出與疾病發生的關聯性。肺結核發生全過程的多基因模型研究,比單個基因研究對個體易感性有更準確地評價,但迄今為止,國外為數不多的多基因模型研究尚無確切的結論和通用的模式。國內單個細胞因子基因多態性與肺結核關系的報道,結論尚不一致,多基因聯合分析至今尚未見報道。本研究發現MBP基因P52位點與VDR基因的FokⅠ位點之間、VDR基因的FokⅠ與 ApaⅠ位點之間存在交互作用。同時攜帶FokⅠ雜合子和ApaⅠ雜合子者發生肺結核的危險性是單一ApaⅠ雜合子攜帶者的3.5倍。叉生分析未能證實MBP基因P52突變型與VDR基因的FokⅠ突變型雜合子的交互作用大小和方向,可能是P52位點突變率較低,需要較大的樣本量來證實。因此,目前對基因與基因交互作用機制和生物學機制的研究樣本量往往有限,分析結果的敏感性和把握度有待提高。

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