脂聯(lián)素基因+45位核苷酸T/G多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性研究

羅素新,雷 寒Δ,柳 青,馬康華,向 林,曹娟娟

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院:1.心血管內(nèi)科;2.臨床研究中心 400016)

脂聯(lián)素(adiponectin)是近年新發(fā)現(xiàn)的一種由脂肪細(xì)胞特異分泌的細(xì)胞因子,一種具有重要保護(hù)作用的激素;其基因位于染色體3q27,全長(zhǎng)16 kb,由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成。目前已發(fā)現(xiàn)10余個(gè)脂聯(lián)素基因常見的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)及一些罕見的錯(cuò)義突變,其中位于外顯子2上的脂聯(lián)素基因+45核苷酸位點(diǎn)存在T→G轉(zhuǎn)換(Gly15Gly),該多態(tài)性最為常見。已有研究表明該多態(tài)性與2型糖尿病和代謝綜合征有關(guān),而與冠心病的相關(guān)性研究報(bào)道較少。本研究旨在了解該多態(tài)性與冠心病的相關(guān)關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇在本院心血管內(nèi)科住院并連續(xù)進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影的398例患者,選取其中的365例患者進(jìn)行了本研究,男251例,女 114例,年齡29～ 79歲,平均(64.15±10.34)歲。對(duì)所有研究對(duì)象詢問(wèn)病史并進(jìn)行體格檢查,測(cè)量身高、體質(zhì)量和血壓,并詢問(wèn)吸煙、高血壓(hypertension,HP)、2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)、高脂血癥病史。計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)=體質(zhì)量/身高2(kg/m2)。入院次日清晨空腹8 h以上經(jīng)前臂靜脈采血,測(cè)定血糖和血脂,包括總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等。所有研究對(duì)象采用INNOVA2000/2000S數(shù)字減影血管造影機(jī),采用Judkins穿刺法經(jīng)股動(dòng)脈途徑進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影,根據(jù)造影結(jié)果采用定量計(jì)算機(jī)分析(QCA)系統(tǒng)測(cè)定冠狀動(dòng)脈狹窄程度。根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果及臨床資料將研究對(duì)象分為3組:冠心病(coronary heart disease,CHD)組:冠心病的診斷系指冠狀動(dòng)脈造影至少有1支冠狀動(dòng)脈血管從兩個(gè)以上不同角度均可以觀察到直徑減少大于或等于 50%和臨床上診斷為心肌梗死,共221例,男166例,女55例,其中心絞痛118例,急性或陳舊性心肌梗死85例,其他類型18例。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化(coronary artery artherosclerosis,CAS)組:冠狀動(dòng)脈造影血管狹窄程度達(dá)不到50%同時(shí)又不能診斷為心肌梗死者納入該組。男28例,女16例,主要包括原因不明的胸痛、胸悶、心律失常、陣發(fā)性室上速行射頻消融術(shù)前等共44例。正常對(duì)照組(normal control,NC):冠狀動(dòng)脈造影血管完全正常者。共100例,男57例,女43例,主要包括原因不明的胸痛、胸悶和陣發(fā)性室上速行射頻消融術(shù)前,已排除 HP、T2DM、高脂血癥、痛風(fēng)等疾病的人群。冠狀動(dòng)脈造影時(shí),通過(guò)放置的股動(dòng)脈鞘采血10 mL,加入已有適量EDTA的50 mL離心管中,混勻,置于-20℃冰箱保存,用于提取基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA抽提 采用改進(jìn)的MILLER鹽析法提取基因組DNA,根據(jù) DNA的線狀分子大小(即總DNA的多少)加入0.3～1.0 mL不等的 TE溶液。置于4℃冰箱,待 DNA充分溶解后,將其轉(zhuǎn)移至1 mL小離心管中置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 脂聯(lián)素基因的PCR擴(kuò)增 以基因組脫氧核糖核酸(DNA)作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增引物序列參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[1],由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。上游引物:5′-GAA GTA GAC TCT GCT GAG ATG G-3′,下 游 引物 :5′-TAT CAG TGT AGG AGG TCT GTG ATG-3′。PCR反應(yīng)體系總體積 30 μ L,包括上游引物(10 μ M)0.6 μ L,下游 引物(10 μ M)0.6 μ L,DNA 模板 1.0 μ L,Taq 酶(5 u/μ L)0.3 μ L,MgCl2(25 mM)1.8 μ L,dNTP(2 mM)3.0 μ L 。 充分混勻,瞬時(shí)離心后放入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃5 min,變性94 ℃30 s,退火58℃30 s,延伸72℃1 min,共30個(gè)循環(huán),終末延伸 72℃ 10 min。取5 μ L PCR產(chǎn)物,2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,紫外燈下呈現(xiàn)372 bp特異PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)方法檢測(cè)脂聯(lián)素基因Gly15Gly多態(tài)性 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 8μL,加入限制性核酸內(nèi)切酶Sma I(4 u)1μ L,10×緩沖液2μ L,30℃水浴箱酶切2 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳(90 V,30 min),凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 資料分析采用SAS8.02統(tǒng)計(jì)分析軟件。以Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)樣本的群體代表性。計(jì)量資料采用表示,用方差分析,兩兩比較用SNK檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用卡方分析(χ2),Fisher精確概率檢驗(yàn)計(jì)算 P值,以 P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算各組基因型頻率和等位基因頻率。等位基因數(shù)計(jì)算:采用平衡法:T=2T T+TG,G=2GG+TG。等位基因頻率計(jì)算:采用平衡法:T=T T+1/2 TG,G=GG+1/2TG。

2 結(jié) 果

2.1 CHD、CAS患者和NC組的臨床和生化特點(diǎn) 由表1可見,3組研究對(duì)象間年齡和體質(zhì)量指數(shù)具有可比性,冠心病組男性比例、TG和LDL-C明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05);冠心病組男性比例也高于CAS組。冠心病組和CAS組伴隨的高血壓病、高脂血癥和2型糖尿病比例與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CHD組除男性比例更高外(P＜0.05),其余各項(xiàng)與CAS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果說(shuō)明CHD組和CAS組均存在相似的脂代謝紊亂、高胰島素血癥和高血壓。

2.2 脂聯(lián)素基因的PCR擴(kuò)增和酶切結(jié)果 脂聯(lián)素基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為372 bp的片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Sma I酶切后,可出現(xiàn)3種片斷大小的組合,分別為野生純合子T T顯示1條帶(372 bp);突變純合子GG顯示為兩條帶GG(216 bp和156 bp);突變雜合子TG顯示3條帶 TG(372 bp、216 bp和156 bp)。脂聯(lián)素基因外顯子2上+45位核苷酸存在T/G多態(tài)性為同義突變即GGT→GGG(Gly15Gly)。當(dāng)+45位核苷酸為G時(shí),存在Sma I限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn),而為T時(shí)則該酶切位點(diǎn)消失。因此,當(dāng)基因型為GG時(shí),酶切產(chǎn)物電泳后有156 bp和216 bp 2條帶;基因型為T T時(shí),只有372 bp 1條帶;基因型為TG 時(shí),有156 bp、216 bp和372 bp 3條帶(圖1)。本組365例研究對(duì)象用PCR-RFLP方法確定基因型,其中 T T基因型有 171例,占 46.85%,TG基因型有155例,占42.47%,GG基因型 39例,占10.68%。T等位基因頻率為68.08%,G等位基因頻率為31.92%。

表1 研究對(duì)象的臨床和生化特點(diǎn)

2.3 各組脂聯(lián)素基因型頻率和等位基因頻率的分布(表2)因CAS組病例數(shù)較少,將其和NC組合并為非CHD組進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明CHD組和非CHD組以及CHD組和NC組之間脂聯(lián)素基因型頻率和等位基因頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 3組脂聯(lián)素基因型頻率和等位基因頻率比較

圖1 脂聯(lián)素基因+45位多態(tài)性分型結(jié)果

3 討 論

脂聯(lián)素作為脂肪細(xì)胞特異分泌的細(xì)胞因子,在多種疾病狀態(tài)中其血清水平明顯降低,提示脂聯(lián)素具有多方面的保護(hù)作用。多項(xiàng)臨床研究[2-3]發(fā)現(xiàn)冠心病患者血脂聯(lián)素的水平顯著低于無(wú)冠心病者,提示脂聯(lián)素水平下降可能是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素。

實(shí)驗(yàn)研究[4]表明脂聯(lián)素可能通過(guò)參與動(dòng)脈粥樣硬化形成的各個(gè)環(huán)節(jié)而對(duì)冠狀動(dòng)脈疾病起到保護(hù)作用。在對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠-脂聯(lián)素缺陷[adipo(-/-)]小鼠的研究[5]發(fā)現(xiàn),adipo(-/-)小鼠血管受到球囊擴(kuò)張損傷后,發(fā)生了較野生型小鼠更為嚴(yán)重的內(nèi)膜增厚,為脂聯(lián)素在生物體內(nèi)抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用提供了直接證據(jù)。

脂聯(lián)素基因定位于染色體3q27,由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成,脂聯(lián)素由2號(hào)及部分3號(hào)外顯子編碼。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素基因存在多個(gè)突變位點(diǎn)。有研究[6]認(rèn)為脂聯(lián)素基因可能是T2DM的易感基因。多數(shù)研究表明脂聯(lián)素基因多態(tài)性與T2DM、胰島素抵抗及肥胖相關(guān)[6-7]。

脂聯(lián)素基因的突變與冠心病的相關(guān)報(bào)道較少。有研究[8]發(fā)現(xiàn)在脂聯(lián)素基因內(nèi)含子276位上為G/G基因型的個(gè)體患冠心病的危險(xiǎn)性比T/T基因型的個(gè)體明顯增加,即276位上G→T變異可減少冠心病的發(fā)生。但Filippi等[9]報(bào)道脂聯(lián)素基因內(nèi)含子276位上為G/G基因型的個(gè)體只在早發(fā)(≤50歲)患者中患冠心病的危險(xiǎn)性增加,在晚發(fā)冠心病患者中起決定作用的則是其他的心血管危險(xiǎn)因素。

Dhashi等[10]對(duì)383例血管造影確診的冠狀動(dòng)脈疾病者及368例非冠狀動(dòng)脈疾病者取血樣,通過(guò)Tapman PCR來(lái)檢測(cè)脂聯(lián)素基因的單核苷酸多態(tài)性,或PCR分析檢測(cè)法來(lái)分析限制性酶切片段的多態(tài)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNP276與冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)生及血漿脂聯(lián)素水平不相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈疾病患者和代謝綜合征患者I164T的突變率明顯高于對(duì)照組,I164T的突變者血漿脂聯(lián)素水平明顯低于無(wú)突變者,無(wú)體質(zhì)量指數(shù)依賴性,故認(rèn)為在日本人群中脂聯(lián)素基因I164T突變是代謝綜合征及冠狀動(dòng)脈疾病發(fā)生的共同基因背景,但I(xiàn)164T突變率極低,在CHD患者為2.9%,在正常人群為0.8%。

對(duì)脂聯(lián)素基因外顯子2上最為常見的+45位 T/G多態(tài)性與冠心病發(fā)病之間的關(guān)系報(bào)道結(jié)果亦不盡一致。本研究對(duì)221例通過(guò)冠脈造影和臨床證實(shí)的冠心病患者采用 PCRRFLP方法分析脂聯(lián)素基因+45位T/G多態(tài)性。結(jié)果表明,冠心病組和非冠心病組之間及冠心病組和正常對(duì)照組之間脂聯(lián)素基因型頻率和等位基因頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與文獻(xiàn)報(bào)道[8-10]基本一致。Bacci等[8]研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素SNP+45與意大利T2DM患者是否伴發(fā)冠心病無(wú)相關(guān)關(guān)系。Filippi等[9]研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論在早發(fā)(≤50歲)還是晚發(fā)冠心病患者中脂聯(lián)素基因SNP+45與冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯相關(guān)。但Lacquemant等[11]對(duì)高加索人中單純的 T2DM和合并有冠心病的T2DM患者之間比較脂聯(lián)素SNP+45的研究發(fā)現(xiàn),不論單變量分析還是多變量分析,SNP+45即T→G變異均與冠心病發(fā)病顯著相關(guān)(P＜0.01),而且SNP+45T→G易患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)獨(dú)立于其他的傳統(tǒng)心血管危險(xiǎn)因素。雖然脂聯(lián)素基因SNP+45在冠心病的發(fā)生發(fā)展中的作用還需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí),該作者也認(rèn)為,脂聯(lián)素可能促成了高風(fēng)險(xiǎn)人群如T2DM患者更易患冠狀動(dòng)脈粥樣硬化疾病。

本研究結(jié)果表明脂聯(lián)素基因+45位核苷酸T/G多態(tài)性與重慶地區(qū)漢族人群中冠心病無(wú)明顯相關(guān)性,提示脂聯(lián)素基因可能不是冠心病的易感基因。究竟脂聯(lián)素基因+45位T/G多態(tài)性與冠心病的關(guān)系如何,可能需要更大樣本、分層、分亞組進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

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