青蒿琥酯對UUO模型大鼠腎臟的抗炎作用及其機制研究*

馬行一,吳蔚樺,曾 燕,馬云霞,米緒華

(四川大學華西醫院腎臟內科 640041)

抗瘧疾藥物有效成分青蒿素由中國藥學工作者于1971年分離成功,后又在此基礎上開發雙氫青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥脂等衍生物[1]。新近發現青蒿素類藥物還有抗纖維化、抗腫瘤、抗炎等作用。在本研究的前期研究中,通過應用青蒿琥脂干預UUO大鼠,也發現其可降低 UUO大鼠模型腎間質CTGF和α-SMA的表達并呈劑量依賴性[2]。本研究在原有工作基礎上,進一步采用左側輸尿管結扎大鼠模型,觀察青蒿琥脂干預動物模型的抗炎作用,探討青蒿素類藥物在腎臟病領域的應用。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雄性Wistar大鼠90只,4～6周齡,體質量(200±20)g,購自四川大學華西實驗動物中心。隨機分為假手術組(SOR組)、模型組(UUO組)、青蒿琥酯小劑量治療組(SDA組)、青蒿琥酯大劑量治療組(HDA組)和氯沙坦組(ARB組)。

1.2 試劑及主要設備 青蒿琥酯片(50 mg/片)、氯沙坦鉀片(50 mg/片)、注射用苯唑西林鈉。兔抗大鼠磷酸化NF-Kappa B多克隆抗體(ser276)(cell signaling#3037)、兔抗大鼠Smad 7多克隆抗體(武漢博士德BA1399)、HRP標記羊抗兔IgG(北京中山生物技術公司)、Trizol(美國,BRC)、RNA提取試劑盒(QIAGEN)、反轉錄試劑(立陶宛 MBI)、dNTP(Promega)等。DNA Engine OpticonTM實時熒光定量PCR儀(美國M J Research公司)。

1.3 引物與 Taqman探針序列 Taqman探針5′端標記的FAM為熒光報告基團,3′端標記的TAM RA為熒光淬滅基團。引物及探針序列見表1。

1.4 動物分組及造模型 動物適應喂養后,按照前期實驗方法[2]制備(UUO)動物模型,SOR組除不結扎離斷輸尿管外,其余同UUO組。從術后24 h開始,HDA、SDA組分別給予青蒿琥酯50 mg? kg-1? d-1、25 mg?kg-1? d-1灌胃,ARB組給予氯沙坦鉀20 mg?kg-1?d-1灌胃,SOR組和 UUO組給予等比例生理鹽水灌胃。術后第3、7天隨機處死各組大鼠6只。取右腎組織,部分保存于Carnoy′s固定液中,用于 HE、Masson染色和免疫組織化學檢測;部分液氮快速冷卻以提取mRNA。

表1 PCR引物及探針序列

1.5 主要觀察指標和方法

1.5.1 大鼠處死前心臟取血檢測血肌酐水平。

1.5.2 HE染色、Masson染色觀察一般病理變化,電鏡觀察腎臟組織細胞變化。

1.5.3 免疫組織化學染色檢測磷酸化NF-Kappa B 本研究采用SP法檢測磷酸化NF-Kappa B的P56亞基核轉移的情況。染片后在光鏡下選擇10個連續不重復視野(×1 000倍),以光鏡下細胞核被染成棕黃色為核陽性細胞。計數各視野中核陽性細胞數量,取平均值為該片核陽性細胞數,結果以(核陽性細胞數/HP)表示。

1.5.4 實時熒光定量 PCR法檢測各組 Smad 7和 Iκ B-α的mRNA表達 將Trizol法提取的組織RNA用紫外分光光度計測定濃度后,取總RNA進行逆轉錄反應。采用DNA Engine OpticonTM實時熒光定量PCR儀以30 μL反應體系進行PCR擴增。采用β-actin為內參照。讀取待測目的mRNA進入指數增長期的循環數記為CT值,經內參校正后與SOR組比較,求出樣本針對SOR組的相對拷貝數,即以待測標本基因表達與SOR組基因表達的倍數關系進行數據統計分析。

1.6 統計學方法 運用SPSS13.0統計軟件包處理。組間差異比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),進行統計分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠一般情況及血生化指標 實驗開始前,各組大鼠體毛、色澤正常無明顯差異,尾部紅潤,正常進食,活動靈敏,對聲響、光等刺激反應迅速,機敏,生長正常,大小便無異常表現。行造模手術后,各組手術大鼠出現不同程度活動減少,進食減少,毛色暗淡。造模手術各組實驗大鼠血肌酐水平均有不同程度升高,以UUO組明顯。不同時點觀察,各治療組大鼠血肌酐水平無明顯差異,見表2。

2.2 各組大鼠腎組織病理表現 SOR組HE染色各時間點未見腎臟有明顯異常;UUO術后3 d可見遠端小管擴張,上皮細胞輕度濁腫、空泡變性,腎間質輕度水腫,間質內有散在淋巴細胞、巨噬細胞浸潤,腎小球結構正常;UUO術后第7天可見腎小管上皮細胞腫脹變性,部分細胞嗜酸性變,部分腎小管灶性萎縮,管腔輕度擴張,管腔內見蛋白管型及上皮細胞管型,腎小管間質稍增寬,其間可見成纖維細胞輕度增生及少量淋巴細胞為主的炎細胞浸潤。電鏡下見 UUO大鼠細胞內溶酶體增多,胞漿內可見大小不等的空泡,內質網及線粒體組織改變不顯著,見圖 1、2。

表2 UUO模型各組血肌酐變化(mmol/L)

圖1 腎臟病理7 d標本(×400)

圖2 UUO大鼠腎組織電鏡下表現(×10 000)

表3 NF-Kappa B陽性細胞計數(個/HP)

2.3 NF-Kappa B P65陽性細胞分析 P65陽性細胞SOR組散在可見,隨著各組UUO造模時間延長,P65陽性細胞數顯著增加,以小管細胞核陽性多見。各治療組與UUO組在術后3、7 d比較陽性細胞數各治療組顯著少于 UUO組(P＜0.05),以HDA組減少最為明顯(P＜0.05),見表 3、圖3。

2.4 PT-PCR檢測 按所述反應體系進行45個循環,根據所檢測樣本進入基因對數倍增期所得循環數讀取CT數值,其中Iκ B-α合成片段全長143 bp,Samd 7合成片段全長184 bp。統計分析可見Iκ B-αmRNA在造模后表達明顯下降,其中 UUO組下降最為明顯(P＜0.05),Smad 7的 mRNA表達上升高,藥物干預組Smad 7水平顯著高于 UUO組(P＜0.05),見表 4、5。

圖3 NF-Kappa B陽性細胞染色(×1 000)

表4 Iκ B-α相對拷貝數計算

表5 Smad 7相對拷貝數計算

3 討 論

病理性的炎癥過程貫穿于各種急慢性腎損傷的全過程,是各種常見腎臟疾病造成組織結構及功能損害的重要途徑。腎臟的炎癥發生過程復雜,與多種細胞信號傳導通路及細胞因子關系密切。炎癥過程所導致的結果表現形式多樣,包括腎纖維化損傷、新月體形成、腎小球系膜細胞凋亡損傷過程中,均伴隨有形式多樣的病理炎癥狀態作用。目前炎癥作為發病機制已見于多種腎臟疾病[3-5]。有效的抑制炎癥過程的發生已經成為各種腎臟病新藥開發的共同靶點。

本研究所選取的青蒿琥酯藥理作用及藥代學明確[1],以往作為一種經典抗瘧疾藥物使用,新近發現其還有抗寄生蟲、抗炎等作用[6-7],在腎臟病領域研究目前還處于起步階段,本研究所選擇的觀測指標核因子NF-Kappa B在炎癥過程的發生中居于核心地位。本文所檢測的P65亞基為其中的一個重要功能亞基,在蛋白酶水解NF-Kappa B抑制物后進入細胞核內,啟動炎癥過程;本文所檢測的另一指標Iκ B-α就是一種起重要作用的NF-Kappa B抑制物。由于NF-Kappa B的mRNA表達水平并不能反映NF-Kappa B整個功能水平,所以本研究并未進行P65的mRNA水平檢測。

本研究所采用的單側輸尿管結扎大鼠模型成功復制了腎臟疾病的炎癥發生,電鏡照片也證實這點。從研究結果看青蒿琥酯能有效抑制NF-Kappa B通路的表達,干擾 Iκ B水解而起到抗炎作用,同時也發現青蒿琥酯能上調另一類重要抑制性Smad蛋白——Smad 7的表達。以往對 Smad 7的研究主要局限于其對TGF-β1表達通路的抑制。新近發現 Smad 7可以調控多個與炎癥相關的信號傳導。已有研究發現上調Smad 7表達,可以在UUO大鼠模型及大鼠新月體腎炎模型體現出較好的抗炎效應[8]。由此可見,青蒿琥酯的抗炎效應部分可能是通過上調Smad 7表達所致。

總之,青蒿琥酯有良好的抗炎效應,可以改善UUO模型大鼠炎癥過程的發生,有一定的潛在臨床價值。

[1]戴小軍,劉延慶,梅全喜.蒿屬藥用植物藥理活性研究進展[J].中藥材,2005,28(3):243.

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