AML1/ETO+融合基因陽性的AML患者骨髓細胞形態學分析

王 平,彭賢貴,陳幸華,劉思恒,張 曦,孔佩艷

(第三軍醫大學新橋醫院血液科,重慶400037)

白血病是造血干細胞突變所致的克隆性惡性腫瘤,染色體分析可以揭示其克隆標志,細胞遺傳學較細胞形態學和免疫學表型更能反映白血病的生物學特征。半數以上急性白血病患者可檢出克隆性染色體異常,其中,特異性染色體重排與特定的白血病亞型相關。細胞遺傳學改變是影響白血病預后的因素[1-2]。急性髓細胞白血病(AM L)部分成熟型的M2b亞型是中國學者于20世紀50年代末提出的,具有髓外浸潤率高、治療反應好、完全緩解率高、緩解期長等特點。其特異性遺傳標志為8號與21號染色體的長臂在二區二帶斷裂并相互移位[t(8;21)(q22;q22)],AM L1基因重排可作為診斷本病的分子標志[3]。作者在工作中時常發現運用熒光原位雜交技術(FISH)方法檢測的AM L1/ETO融合基因陽性的病例檢測到異形中幼粒細胞多少不一,但形態學上符合M2b診斷的病例卻很少。2007年10月至2009年4月本院對收治的66例AML患者進行FISH檢測AML1/ETO融合基因,對骨髓形態學特點及AM L1/ETO陽性結果分析,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2007年10月至2009年4月本院進行AML1/ETO檢測的 AM L患者 66例,其中男37例,女 29例,年齡6～64歲,中位年齡46歲。

1.2 形態學 (1)取材:于髂后上棘抽取骨髓液先涂片5～8張用于形態學及細胞化學染色,再抽取1～2 mL用肝素抗凝,用于FISH融合基因檢查。(2)涂片染色:取2張干燥、涂片滿意的骨髓片用瑞氏染液染色10～15 min,油鏡計數200個有核細胞,計算各種有核細胞的構成比。對染色不滿意的骨髓片另取1張重新染色。(3)分型標準:將核漿發育明顯不平衡、胞質中出現中性顆粒、有核仁的細胞劃入“異常中幼粒細胞”,見彩插Ⅱ圖1。AM L形態學分型標準采用國內分型標準[4]。

1.3 FISH AM L1/ETO融合基因檢測 (1)探針:采用英國Cytocell公司雙融合 AM L1/ETO探針,光譜橘紅直接標記ETO和光譜綠色直接標記AML1。(2)方法:廠商提供的操作方法略加修改,簡述如下:①1～2 mL肝素抗凝骨髓血2 500 r/min離心8 min去上清液,加8 mL 0.075 M KCl 30 min;②1 mL固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)吹打混勻1 800 r/min離心8 min去上清液;③6 mL固定液,吹打混勻1 800 r/min離心8 min去上清液,重復 2～3次;④樣本制備、滴片;⑤2×SSC,70%、85%、100%乙醇各2 min;⑥10 μ L探針,18×18蓋玻片,封片膠封片;⑦雜交儀:變性72℃2 min,雜交37℃至少16 h;⑧去蓋玻片,0.3 NP40、0.4 SSC 72 ℃2 min,0.1 NP40、2 SSC 37℃30 s;⑨10 μ L DAPⅡ加蓋玻片暗視野熒光顯微鏡觀察。(3)結果判斷:用配有DAPI/FITC/TRITC三色激發塊的O-lympus BX51熒光顯微鏡檢查雜交信號,用Olympus PM30顯微照相機進行照相。正常間期細胞出現2橘紅2綠色分散熒光信號,出現2黃色1橘紅1綠色信號為AM L1/ETO陽性細胞,每個樣本觀察500個間期細胞并觀察中期分裂相。

表1 66例AM L形態學診斷及AM L1/ETO[t(8;21)(q22;22)]融合基因結果

2 結 果

2.1 形態學 66例AML骨髓細胞形態學分型結果見表1。在AM L1/ETO融合基因陽性病例中,首次化療完全緩解(CR)率 78.4%(9例AML-M2a、8例 AM L-M2b及 1例 MDSRAEB-Ⅱ),4例AML-M2a 2次化療CR,1例 AML-M2a 5次化療仍NR。

2.2 FISH AML1/ETO融合基因檢測結果 見彩插Ⅱ圖2、表2。光譜橘紅標記ETO和光譜綠色標記AML1信號明晰,正常間期細胞2橘紅2綠色分散熒光信號,AM L1/ETO陽性細胞2黃色1橘紅1綠色信號。

表2 AM L1/ETO+融合基因與異形中幼粒細胞比例構成

3 討 論

AM L1/ETO融合基因主要見于白血病M2b亞型,M2b與國際上的[t(8;21)]M2是同一亞型,其特異性遺傳標志為8號與21號染色體的長臂在二區二帶斷裂并相互移位[t(8;21)(q22;q22)],形成AML1/ETO融合基因[5]。急性髓系白血病的其他亞型如M1、M4、MDS-RAEB-1等也有少數病例表達此融合基因[6-8]。本組形態學診斷 AML-M 2b病例均表達AM L1/ETO融合基因(陽性率71%～95%),部分AML-M2a、MDS-RAEB亦表達AML1/ETO融合基因(陽性率27%～94%)。回顧分析AM L1/ETO陽性病例骨髓涂片,都能檢測到異形中幼粒細胞(表2)。AML1/ETO[t(8;21)(q22;q22)]融合基因改變一定伴隨異形中幼粒細胞表達,但異形中幼粒細胞與融合基因表達也有不一致性。本組融合基因陽性率(27%～95%)明顯高于異形中幼粒細胞比例(4.5%～71.5%),基因表達先于骨髓形態表現。

本研究發現在臨床中形態學診斷AML-M2b明顯低于AML1/ETO融合基因檢測陽性率,AM L-M2b臨床診斷明顯較低,其原因可能:(1)AML-M2b主要由形態學界定,其原始粒細胞明顯診斷,以異形中幼粒細胞增生為主并比例大于30%[7];(2)國內外報道急性髓細胞白血病其他亞型如M1、M4、M5等少數病例也表達 AML1/ETO融合基因[6-8]。在這部分病例可能伴有復雜核型,[t(8;21)(q22;q22)]不占主導作用;(3)AM L1/ETO融合基因產生一種嵌合蛋白,作為主要的抑制物改變了正常AM L1-CBF(核結合因子)β這種與造血干細胞分化有關的轉錄復合物的生理功能[5]。部分AM L-M2a、RAEB-Ⅱ,雖然檢測到異形中幼粒細胞但比例小于30%,可能不同白血病細胞分化程度的不同,部分病例可能為疾病較早期;(4)在M2b形態診斷中異形中幼粒細胞辨認至關重要,不同觀察者標準有所不同。綜合張之楠、楊崇禮等[6,9]對異形中幼粒細胞描述,本文將核漿發育明顯不平衡、胞質中可見中性顆粒、有核仁的細胞劃入“異常中幼粒細胞”。

目前一般認為AML1/ETO陽性是預后良好的指標之一,但也有報道預后中等。劉旭輝等[10]報道一個療程化療的CR率(80.6%)高。國內有報道復雜核型的[t(8;21)(q22;q22)]復雜異位的急性髓質白血病的實驗研究,在常規臨床治療中DA化療敏感差[11]。在本組AM L1/ETO融合基因陽性病例中,首次化療 CR率達 78.4%,9例 M 2a、8例 M2b及1例MDS-RAEB-Ⅱ首次化療CR,4例M2a 2次化療CR,1例M2a 5次化療仍NR。出現異形中幼粒細胞比例高的M2b首次緩解率明顯高于其他的AM L/ETO+AM L。AM L1/ETO融合基因產生的融合蛋白與造血干細胞分化有關的轉錄復合物的生理功能[5],異形中幼粒細胞表達的此類物質與化療作用相關。目前還未見異形中幼粒細胞與化療敏感度有關的報道,由于病例總數較少、時間較短,還需要進一步觀察與總結。

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