5種經典耐藥基因在兒童常見惡性腫瘤的表達及臨床意義*

向 麗,金先慶

(重慶醫科大學兒童醫院普外科 400014)

惡性腫瘤已經成為兒童疾病死亡的首要原因。常見的兒童惡性實體瘤有腎母細胞瘤、肝母細胞瘤、橫紋肌肉瘤,神經母細胞瘤、惡性淋巴瘤、卵黃囊瘤等。兒童惡性實體瘤常用的治療包括手術、化療、放療、免疫治療、介入治療、中醫治療、腫瘤的誘導分化治療等,而化療是目前治療兒童惡性腫瘤和有效防治腫瘤轉移、復發的主要手段。盡管新的抗癌藥物和化療方案不斷推出,但治療效果卻不盡如人意,其中一個重要的原因就是腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性。產生耐藥性的腫瘤細胞不僅對使用過的抗腫瘤藥物產生耐藥,而且對多種未曾使用過的結構和作用機制不同的藥物也產生耐藥,這種現象稱為多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)。腫瘤多藥耐藥的機制十分復雜,現在普遍認為其與多種耐藥相關的酶和蛋白有關,如:P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多藥耐藥相關蛋白1(multidrug resistance-associated protein,M RP1)、肺耐藥相關蛋白(lung resistance-associated protein,LRP)、谷胱甘肽轉移酶(glutathione-S-transferase-pi,GST-π)、DNA 拓撲異構酶Ⅱ(topoisomeras,Topo-Ⅱ)等[1-2]。本研究旨在通過對 40例兒童常見實體惡性腫瘤中耐藥基因表達蛋白的分析,探討兒童常見惡性腫瘤的耐藥機制,為臨床化療制定敏感的個體化化療方案提供實驗依據。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2000～2005年重慶醫科大學附屬兒童醫院收治的5種兒童常見惡性實體瘤病例40例,資料完整;病理石蠟切片由重慶醫科大學附屬兒童醫院病理科提供,包括:腎母細胞瘤(10例)、惡性淋巴瘤(19例)、橫紋肌肉瘤(3例)、神經母細胞瘤(3例)、卵黃囊瘤(5例)。其中男23例,女 17例;年齡小于1歲8例,1～3歲11例,大于3歲 21例,平均年齡4歲,中位年齡為4.2歲。

1.2 實驗方法 標本均經10%中性甲醛固定,常規石蠟包埋,5μ m連續切片,50℃恒溫箱中固定72h,梯度酒精脫蠟水化,其余步驟按照SP免疫組化試劑盒說明書進行,DAB顯色,蘇木素復染,中性樹膠固封。鼠抗人 P-gp、M RP、LRP、GST-π、Topo-Ⅱ單克隆抗體及SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑試劑盒均購于福州邁新生物技術開發公司。使用已知陽性片作陽性對照,用PBS代替一抗作陰性對照。P-gp、M RP1、LRP、GST-π表達均位于細胞膜或者細胞漿,Topo-Ⅱ表達位于細胞核上,陽性反應為棕色;每張切片在高倍鏡下計數5個視野,計算其陽性率。判斷標準:陽性細胞數小于10%為陰性(-),10%～25%為(+),25%～75%為(++),＞75%為(+++);達(++)以上為陽性,表示腫瘤對該耐藥基因所介導的藥物具有耐受性。

表1 5種耐藥蛋白在6種常見兒童惡性腫瘤中的表達

1.3 統計學方法 所有數據應用SAS統計軟件行χ2檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 5種耐藥基因蛋白在40例兒童常見惡性腫瘤中的表達情況見表1。

圖1 腎母細胞瘤耐藥蛋白的表達(箭頭示陽性表達,×400)

圖2 霍奇金淋巴瘤耐藥蛋白的表達(箭頭示陽性表達,×400)

2.2 37例有兩種或兩種以上耐藥基因表達陽性,共表達率達92.5%,明顯高于單基因表達率(P＜0.05)。其中9例 5種耐藥基因表達均為陽性,共表達率達22.5%。

2.3 5種耐藥基因蛋白在兒童常見惡性腫瘤表達的免疫組化結果見圖1～6。

圖3 非霍奇金淋巴瘤耐藥蛋白的表達(箭頭示陽性表達,×400)

圖4 神經母細胞瘤耐藥蛋白的表達(箭頭示陽性表達,×400)

圖5 橫紋肌肉瘤耐藥蛋白的表達(箭頭示陽性表達,×400)

圖6 卵黃囊瘤耐藥蛋白的表達(箭頭示陽性表達,×400)

3 討 論

3.1 5種耐藥基因的耐藥機制 P-gp是由M DR1基因編碼的一種能量依賴性藥物排除泵,當藥物進入細胞后,P-gp結合藥物分子,同時其A TP位點結合ATP后釋放能量,使藥物轉運到胞外,也可直接從胞膜排除藥物,使胞內藥物濃度始終維持于低水平,由此可介導植物堿類、阿霉素、紫杉醇、泰素帝等抗癌藥物的耐藥。P-gp在人類正常組織中有不同程度的表達,其中腎上腺、肺臟、胃腸、胰腺、腎臟等組織中表達較高,而在卵巢、胸腺、骨髓中表達率很低甚至不表達[3-4],這也解釋了抗癌藥物為何會引起對造血系統的嚴重損壞從而導致化療療程的縮短或中斷。P-gp主要分布在有分泌功能的上皮細胞中,可轉運蛋白、碳水化合物、藥物、色素等物質,所以其不僅是引起腫瘤組織耐藥的主要機制之一,而且在機體分泌、排泄功能中也起著特殊的作用。

MRP與P-gp同屬ABC超家族膜轉運蛋白,可轉運多種有機陰離子物質,如一些內源性或外源性物質(還原性谷胱甘肽GSH、葡萄糖醛酸、硫酸鹽共軛結合物等)。它也是一種ATP依賴泵,能將帶負電荷的藥物分子逆濃度泵出到細胞外,還可通過改變細胞漿及細胞器的pH值,使藥物到達作用部位的靶位點時濃度減少,從而產生腫瘤耐藥。MRP與P-gp之間存在交叉耐藥種類,包括長春堿類、阿霉素、足葉乙甙等,均為能與GSH共軛結合的藥物。

LRP是穹隆蛋白的主要成分,阻止以細胞核為靶點的藥物通過核孔進入胞核,并將進入胞漿的藥物轉運到運輸囊泡中,以胞吐的方式排出體外,從而影響藥物的胞內轉運與分布,致靶點藥物有效濃度下降而產生耐藥。LRP分布在人體體腔上皮、分泌器官等正常組織中,也不同程度的表達于各種腫瘤組織中,主要介導阿霉素、鉑類、柔紅霉素、米托蒽醌、烷化劑等的耐藥。

GST是機體中催化GSH與親電物質發生結合的一類酶系,具有多種生物學功能,結構多樣,分為α、μ、θ、π等膜結合微粒體,其中GST-π與惡性腫瘤耐藥關系最密切。卵巢并不是P-gp的富集器官,但GST-π卻是優勢亞型,腫瘤高表達也正反映了其胚胎特征[5]。GST-π不僅可催化親電物質與GSH結合,本身可和親脂性細胞毒藥物結合,增加其水溶性促進代謝,最終將毒性物質從尿液中排出或降解為無毒性的醇類物質,從而降低抗腫瘤藥物的細胞毒作用,其只要介導對順鉑、氮芥類、烷化劑、蒽環類等的耐藥。

Topo是一種能催化DNA超螺旋結構局部構型改變的基本核酶,分為Ⅰ、Ⅱ類,其中Topo-Ⅱ與細胞耐藥關系密切。化療藥物通過該酶與DNA交聯形成共價復合物,即可分割復合物引起DNA斷裂,導致腫瘤細胞死亡。DNA拓撲異構酶同時又是許多化療藥物重要的攻擊靶點,導致該酶減少或活性下降,使得可分割的復合物減少,腫瘤細胞DNA損害減少,并具有修復力,使腫瘤細胞不因DNA斷裂而死亡,從而產生耐藥。Topo-Ⅱ表達越低提示對化療藥物越不敏感,又因其與腫瘤細胞的增殖活性密切相關,成為反映腫瘤細胞生物學行為和預后的重要標記物。以Topo-Ⅱ為靶點的藥物主要為蒽環類、鬼臼霉素、阿霉素等。

3.2 5種耐藥蛋白在兒童惡性腫瘤中的表達特點及共表達現象 本研究結果顯示,腎母細胞瘤、惡性淋巴瘤、橫紋肌肉瘤、神經母細胞瘤、卵黃囊瘤中 P-gp、M RP、LRP和 GST-π表達相對較高,Topo-Ⅱ普遍表達較低,提示P-gp、MRP、LRP、GST-π的高表達和Topo-Ⅱ的低表達均可導致腫瘤組織的耐藥,這與有關報道相符。事實上,腫瘤化療的耐藥性常常是多種耐藥蛋白參與及不同機制共同作用的結果[6-7]。本實驗結果顯示,兩種或兩種以上耐藥基因的共表達率達92.5%,5種耐藥基因均表達率達 22.5%,表明 P-gp、M RP、LRP、GST-π、Topo-Ⅱ 不同程度地同時參與了腫瘤的耐藥形成,表達上的差異性與不一致性也正說明了影響腫瘤耐藥機制的多因素性。有學者提出這些耐藥基因間不存在相互關聯性,各自發揮耐藥作用[8]。因此,聯合檢測腫瘤多個耐藥相關標志,同時評估多個耐藥基因的表達,能更加客觀地反映腫瘤的耐藥情況。臨床上可依據耐藥機制的不同優化治療方案,實現個體化化療,以增強療效。

3.3 耐藥蛋白在兒童惡性實體瘤中表達的臨床意義及應用兒童惡性腫瘤的耐藥蛋白的進一步認識,對于兒童惡性腫瘤的臨床化療的盲目性有一定的指導作用,目前兒童惡性腫瘤的化療方案來源于書本、文獻或醫師的個人經驗,本實驗結果對兒童惡性腫瘤的臨床治療有一定的指導意義。目前治療惡性淋巴瘤的化療藥物有環磷酰胺、長春新堿、阿霉素、表阿霉素、博萊霉素、長春花堿、足葉乙甙、氮芥等[9]。本研究結果顯示兒童惡性淋巴瘤中P-gp耐藥表達高,MRP1的表達較低,如P-gp的主要耐藥藥物是阿霉素、柔紅霉素、表阿霉素、長春花堿、長春新堿等,M RP1的主要耐藥藥物是阿霉素、長春新堿、鬼臼乙叉甙、柔紅霉素等,在選擇時以環磷酰胺、博萊霉素、氮芥、鬼臼乙叉甙等作為一線基礎藥,從而提高對兒童惡性淋巴腫瘤藥物治療的療效。

兒童惡性腫瘤以胚胎為主,位于軟組織內,腫瘤與周圍組織的關系密切,這一特點給手術造成一定的難度,而通過術前化療就可以使瘤體充血減少,瘤體體積縮小,與周圍組織界限更清楚,同時減少術中出血。這明顯表明術前化療的重要性。對于兒童惡性實體瘤的治療方法中術前化療可以作為一種常規的治療方法。而明確各種兒童腫瘤耐藥基因的表達特點可以為臨床化療提供理論依據,做到有的放矢,高效、快速的殺滅腫瘤細胞,提高治愈率,改善患兒的生活質量。

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