Survivin、VEGF、Caspase-3 在血管瘤不同時期的表達及其相關性研究

張莉 張成書 李旭文 王懷谷 徐靜 李光早 林曉曦

血管瘤是嬰幼兒最常見的良性腫瘤，其確切的發病機制目前尚未闡明[1]。血管瘤具有很奇特的自然病程：出生后1～12個月瘤體迅速增大（增生期），隨后的2～5年內出現緩慢的、必然的消退（消退期）。由于這一特殊的生物學現象，血管瘤增生與消退的機制一直是人們研究的熱點。張莉等[2]用基因芯片技術檢測增生期和消退期血管瘤差異基因的表達,發現大量與細胞增殖相關的基因在增生期高表達，而與細胞凋亡有關的基因在消退期高表達，提示血管內皮細胞的增殖和凋亡與血管瘤的增生和消退密切相關，即血管瘤的增生和消退可能就是血管瘤內皮細胞增殖和凋亡的外在表現，但引起血管瘤內皮細胞增殖和凋亡的分子機制尚不明確。

本實驗擬用免疫組織化學方法，檢測不同時期血管瘤組織中的Survivin、VEGF和活化Caspase-3的表達，并且進行相關性分析，探討上述分子的變化對血管瘤增生、消退病程演化的影響，為臨床治療血管瘤提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集我院病理科2005年至2008年血管瘤蠟塊標本45例，其中女性35例，男性10例；年齡最小1月齡，最大5歲。依據Mulliken對血管瘤的分期標準，并經病理證實，確診增生期血管瘤30例，消退期血管瘤15例。另以瘤體周圍正常皮膚組織15例為正常對照。

1.2 免疫組化染色

1.2.1 載玻片的處理

重鉻酸鉀-硫酸液浸泡24 h，用流水沖洗2 h，置于60℃溫箱中烤干，并以1∶10多聚L-賴氨酸溶液浸數秒，瀝干，置于60℃溫箱中烤干備用。

1.2.2 免疫組化染色

石蠟切片經二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后，蒸餾水沖洗3遍，滴加3%H2O2，室溫孵育10 min，置于抗原修復液，中火修復10 min，室溫冷卻20 min，蒸餾水沖洗2遍，0.1%PBS液沖洗2遍，甩去PBS液，滴加50 μL非免疫動物血清，室溫下孵育10 min，滴加一抗50 μL，4℃溫箱中過夜。切片取出后PBS沖洗3 min（3次），滴加生物素標記的第二抗體50 μL，室溫下孵育 10 min，PBS 液沖洗 3 min（3 次），滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液50 μL，室溫下孵育 10 min，PBS液沖洗 3 min（3次），滴加 100 μL新鮮配置的二氨基苯聯氨（DAB），顯色5 min，自來水沖洗，蘇木素復染，中性樹膠封片。分別設立陽性對照和陰性對照。陽性對照即試劑公司提供的陽性照片，陰性對照為一抗用PBS液。

1.2.3 染色結果的評定

由兩位病理科醫師采用雙盲法對結果進行評定。光鏡下觀察，免疫組織化學染色顯示：VEGF陽性時，細胞質有棕黃色細顆粒沉著；Caspase-3陽性時，胞漿或胞核出現黃色、棕黃色、棕褐色細顆粒沉著；Survivin陽性時，胞核出現棕黃色、棕褐色細顆粒沉著。評定標準如下：以同一顯微鏡倍數（400×）觀察全片，選擇5個高倍視野，合并計算所分析的5個不同視野染色的強度及陽性細胞百分率?；静蝗旧邽?分，染色淡者為1分，染色中等者為2分，染色深者為3分。陽性細胞百分率小于5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為 2分，大于 51%為3分。將每張片子的染色強度得分與陽性細胞百分率得分各自相乘，則為陽性系數。陽性系數0～1分者為陰性（-），2～3 分者為弱陽性（＋），4～6 分者為中等陽性（＋＋），9 分者為強陽性（＋＋＋）。 陽性表達率以表達陽性的病例（包括弱陽性、中等陽性和強陽性之和）占總病例數的百分比表示。

1.3 統計學分析

以SPSS 11.5軟件對數據進行處理，統計方法為Kuskal-Wallis H檢驗、Mann-Whittney U檢驗、Spearman等級相關分析，P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 Survivin在血管瘤和正常組織中的表達

Survivin主要在血管瘤內皮細胞胞核中表達，增生期陽性（+～＋＋＋）表達率為 80%（24/30）；消退期陽性（+～＋＋＋）表達率為 60%（9/15）；在正常組織中不表達。血管瘤增生期與消退期的差異有統計學意義（P<0.05）；增生期和消退期分別與正常組織比較，差異均有顯著意義（P<0.01）（表 1）。

表1 Survivin在血管瘤及正常組織中的表達

2.2 VEGF在血管瘤和正常組織中的表達

VEGF主要在血管瘤內皮細胞的胞漿和胞膜表達，增生期和消退期陽性（+～＋＋＋）表達率分別為90%（27/30）和 46.7%（13/15），具有顯著性差異（P<0.01）；在正常組織不表達。增生期與消退期血管瘤與正常組織相比，差異均具有顯著意義（P<0.01）（表2）。

表2 VEGF在血管瘤及正常組織中的表達

2.3 活化Caspase-3在增生期、消退期血管瘤及正常組織中的表達

血管瘤中活化Caspase-3增生期主要在內皮細胞核中表達，消退期也出現在胞漿中，增生期和消退期陽性（+～＋＋＋）表達率分別為 60.0%(18/30)和 86.7%(13/15)，在正常組織中不表達。血管瘤在增生期與消退期的差異具有顯著意義（P<0.01），增生期、消退期與正常組織的差異均有顯著意義（P<0.01）（表3）。

表3 活化Caspase-3在血管瘤及正常組織中的表達

2.4 血管瘤組織中Survivin和VEGF的相關性

經Spearman等級相關分析，Survivin和 VEGF在45例血管瘤組織的表達具有正相關性 （r=0.54，P<0.01）（表 4）。

表4 血管瘤中Survivin和VEGF表達的相關性

2.5 血管瘤組織中Survivin和活化Caspase-3的相關性

經Spearman等級相關分析，Survivin和活化Caspase-3在45例血管瘤組織的表達具有負相關性（r=-0.51，P<0.01）（表 5）。

表5 血管瘤中Survivin、Caspase-3表達的相關性分析

3 討論

血管瘤增生和消退的確切發病機制目前尚不明確，血管內皮細胞增殖和凋亡相關因子在該機制中的作用是目前研究的熱點。

本實驗發現，VEGF在增生期血管瘤的陽性率為90%（27/30），明顯高于消退期和正常組織，與文獻報道一致[3]。Caspase-3是細胞凋亡的重要信號分子，其活化可誘導血管瘤內皮細胞發生凋亡，并可能最終導致血管瘤的自發消退[4]。本實驗顯示，活化Caspase-3在消退期的陽性率為86.7%，明顯高于增生期血管瘤（60.0%）和正常組織（不表達）。Survivin是新近發現的、最強的凋亡抑制蛋白，表達不足可導致內皮細胞及新生毛細血管的退化[5]。我們發現，其在增生期血管瘤中的陽性表達率（80%）明顯高于消退期（60%）和正常組織（不表達），提示Survivin可抑制血管瘤內皮細胞凋亡，促進血管瘤組織增生，是調控血管瘤內皮細胞凋亡的重要基因之一。

通過等級相關分析，我們發現血管瘤組織中VEGF和Survivin的表達具有強正相關性，提示血管瘤內皮細胞中Survivin的高表達可能與VEGF表達上調有關。VEGF刺激血管瘤內皮細胞增生，還通過Survivin抑制了內皮細胞的凋亡，它們共同作用促成了血管瘤早期的快速增生。Survivin在增生期血管瘤高表達，在退化期血管瘤中低表達；而活化Caspase-3的表達則相反，兩者的表達呈負相關，證實在血管瘤的增生過程中，Survivin可能通過抑制Caspase-3而參與了血管瘤的發生；相反，血管瘤的消退則可能是由于Survivin的表達降低，Caspase-3的活性增高，誘導血管瘤內皮細胞凋亡所致。

我們對比了血管瘤增生期和消退期中Survivin、VEGF、Caspase-3的表達及其相關性，發現三者在血管瘤的不同時期表達不同，且具有相關性，其差異變化可能主導了血管瘤增生、消退的演化過程。結果提示，血管瘤內皮細胞中高表達的VEGF一方面促進自身的增殖，另一方面上調了Survivin的表達，抑制了Caspase-3等凋亡蛋白的活性，從而導致了血管瘤早期的快速增生；相反，VEGF的表達下調，減少了凋亡抑制蛋白Survivin的表達，使凋亡蛋白Caspase-3等活性升高，促進了內皮細胞的凋亡，使血管瘤趨于消退。結合文獻分析[6-7]，可以推測，在血管瘤的增生與消退過程中，VEGF/Survivin抑制Caspase-3的途徑可能起著關鍵性的作用，將來有望通過改變VEGF/Survivin抑制Caspase-3的途徑中的某一環節，如用反義核苷技術和/或RNA干擾技術等阻斷VEGF或Survivin在血管瘤中的表達，提高Caspase-3的活性，誘發血管瘤內皮細胞的凋亡，促進血管瘤的早日消退，為血管瘤的基因治療開辟新的途徑。

[1]Lo K,Mihm M,Fay A.Current theories on the pathogenesis of infantile hemangioma[J].Semin Ophthalmol,2009,24(3):172-177.

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