淋巴管內皮細胞與PGA的相容性研究

戴婷婷 蔣朝華 周廣東 劉偉 李圣利

組織工程技術構建淋巴管的關鍵是要形成淋巴管內皮細胞（Lymphatic endothelial cells，LEC）與生物支架的三維復合體。目前，組織工程研究中，應用較多的可降解人工合成材料是聚羥基乙酸（Polyglycolic acids，PGA）。該材料可加工成直徑 15 μm 的纖維，具有以下特點：能形成穩定的三維空間結構；具有較好的生物相容性；通過調整分子量大小，可以控制降解速度；其體內最終降解產物為CO2和水，對機體無毒副作用。作為一種生物相容性良好的人工合成生物材料，PGA已在軟骨、骨和肌腱等組織工程的臨床研究中顯示出巨大的優勢和應用潛力[1-3]。

本實驗選用PGA作為人LEC黏附生長的支架，研究LEC與PGA的生物相容性，探討PGA支架應用于組織工程化淋巴管構建的可能性

1 材料和方法

1.1 生物支架PGA的制備

取直徑為15 μm，重量為60 mg的PGA纖維（ALBANY公司），制成20 mm×15 mm×1 mm的薄片，75%乙醇浸泡1 h后，PBS反復沖洗3次，吸干水分后，紫外燈照射30 min消毒備用。

1.2 LEC的分離、培養

取幼兒包皮環切術后廢棄的包皮，2塊為一組，反復清洗，去除皮下疏松結締組織，采用中性蛋白酶（Roche 公司）結合膠原酶（Gibco 公司）消化，CD34陰性分選和CD31陽性磁珠（Dynal公司）分選，獲得CD34－/CD31＋細胞[4-6]。用完全內皮細胞培養基（EGM-2-MV）（Lonza公司）重懸細胞，計數，調整細胞濃度至1×105cells/mL后，接種于用20 ng/mL纖維連接蛋白（Sigma公司）鋪底的6孔板中培養。3～4 d換液1次。細胞生長到90%融合后，以0.05%胰蛋白酶消化，1∶3～4傳代于6孔板中 （無需纖維連接蛋白鋪盤）。用于制作細胞爬片的玻片也需預先用20 ng/mL纖維連接蛋白處理。

1.3 細胞免疫熒光鑒定[7-9]

CD34－/CD31＋細胞爬片用4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次，分別滴加鼠抗人Podoplanin抗體（1∶100）和 VEGFR-3 抗體（1∶100），37 ℃孵育30 min；PBS漂洗3次，滴加FITC熒光二抗，37℃孵育30 min；PBS漂洗3次，蒸餾水漂洗3次，熒光顯微鏡觀察。

1.4 細胞與PGA支架復合物的體外培養

消化、離心第4代LEC，將細胞濃度濃度至1×107cells/mL，制成細胞懸液，接種到PGA支架上，置 37℃、5%CO2細胞培養箱中，4 h后加 10 mL EGM-2培養液，培養7 d，每隔2天換液一次。

1.5 掃描電鏡觀察

取培養1周的LEC-PGA復合物，PBS洗滌，2.5%戊二醛固定，系列脫水，乙腈置換，真空干燥，表面噴金后行掃描電鏡觀察并攝像。

1.6 RT-PCR檢測

取培養1周的LEC-PGA復合物，TRIzol法行RNA 抽提。 RT：20 μL 反應體系，25 mmol/L MgCl24 μL，10×逆轉錄緩沖液 2 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，40 U/L RNase抑制劑 0.5 μL，5 U/L AMV 逆轉錄酶1 μL，200 ng／I～LOligo dT-Adaptor Primer 1 μL，RNA 2 μg，加無 RNase 水至 20 μL；反應條件為 30℃ 10 min，42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。PCR：引物序列包括人Prox上游引物5-CTCATAAAGTCCGAGTGCG-3， 下 游 引 物 5－AACATCTTTGCCTGCGATA-3；人Podoplanin上游引物5-GTGTAACAGGCATTCGCATCG-3，下游引物5-GGCAAGTGTTCCACGGGTC-3；人LYVE-1上游引物5-GTTTCTTTCATGCTCCTTACCC-3，下游引物5－GTCTCAGTGACTCCTTGGCTTT-3； 人 VEGFR-3上游引物5-AGAGGAACCAGGAGGACAAG-3，下游引物 5-CAGGTGCTGAAGGGACATT-3。 20 μL 反應體系：ddH2O 13.8 μL，25 mmol／L MgC121.6 μL，10×逆轉錄緩沖液 2 μL，10 mmol／L dNTP 0.5 μL，5 U/L Taq 酶 0.5 μL，cDNA 1.0 μL，20 pmo～L 目的基因上下游引物各0.3 μL。反應條件：95℃變性5 min；95℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s， 共 35 個循環；72 ℃延伸10 min。電泳圖像分析：PCR產物 20 μL經1.2%瓊脂糖、70 V電壓電泳1.5 h后，進行圖像分析。

2 結果

2.1 LEC的鑒定

酶消化結合免疫磁珠分選法獲取的LEC，純度高，呈內皮細胞典型的鋪路石樣排列（圖1）；細胞免疫熒光檢測顯示，CD34－/CD31＋細胞呈現LEC特異性標志Podoplanin和VEGFR-3（圖2）。

圖1 單層培養的LEC呈典型的鋪路石樣排列（40×）

圖2 細胞免疫熒光染色

2.2 LEC-PGA復合物掃描電鏡觀察

復合物體外培養3 d時，可見單個LEC呈類圓形，較扁平，細胞在與PGA接觸部位伸出細小偽足，黏附于PGA纖維；體外培養1周后，可見細胞分泌大量細胞外基質（圖3）。

圖3 LEC-PGA掃描電鏡觀察

2.3 RT-PCR

瓊脂糖凝膠電泳顯示，構建產物能特異性表達LYVE-1 mRNA、Podoplanin mRNA、Prox-1 mRNA和 VEGFR-3 mRNA（圖 4）。

圖4 RT-PCR檢測LEC特異性表型

3 討論

淋巴系統阻塞性疾病的治療，迄今仍然是臨床的難題[10]。通過顯微淋巴外科技術吻合淋巴管，實現淋巴回流的重建，是目前治療阻塞性淋巴水腫的有效手段。但淋巴管移植材料缺乏，自身淋巴管移植后易引起供區水腫。組織工程技術的發展為上述難題的解決提供了新的思路[11-12]。

淋巴管內皮細胞層是執行淋巴管生理功能的重要物質基礎。因此，獲取足夠量的健康、有活力的種子細胞是構建淋巴管內皮層的首要問題。我們從幼兒包皮組織中獲取大量的LEC[5-6]，同時還證實了凍存的內皮細胞復蘇后無明顯形態學改變，并保持了較高的活力及體外增殖能力[13]。此方法獲得的LEC經過鑒定，不僅純度高，而且表型可以維持10代以上。我們采用第4代細胞接種材料，細胞狀態成熟穩定，增值能力強，接種時將其調整到合適的細胞濃度（5×107cells/mL），使其達到與PGA支架復合的最佳條件。PGA纖維為細胞生長、遷移、分化和細胞外基質的分泌提供了條件，同時伴隨著自身的降解，引導新生的組織按照支架模型的三維結構生長。PGA是典型的合成可降解聚合物，降解后生成羥基乙酸。由于羥基乙酸是體內三羧酸循環的中間代謝物，且吸收和代謝機理已經明確，并具有可靠的生物安全性，已被美國FDA批準用于臨床，廣泛用于組織工程化軟骨、骨、肌腱和皮膚等的研究。Niklason等[14]以PGA為支架材料，成功構建了組織工程化血管。

本實驗首次選用PGA作為支架材料，進行LEC-PGA復合物體外培養研究。結果表明：淋巴管內皮細胞可在PGA形成的三維空間結構中生長并分泌基質，維持其表型不變；PGA對細胞生長無明顯不良影響。綜上所述，可以認為PGA是構建組織工程化淋巴管內皮層的合適材料。我們將在此基礎上，進一步開展構建含平滑肌層與內皮層的組織工程化淋巴管的研究。

[1]Cao Y,Vacanti JP,Paige KT,et al.Transplantation of chondrocytes utilizing a polymer-cell construct to produce tissue-engineered cartilage in the shape of a human ear[J].Plast Reconstr Surg,1997,100(2):297-302.

[2]Zhou G,Liu W,Cui L,et al.Repair of porcine articular osteochondral defects in non-weightbearing areas with autologous bone marrow stromal cells[J].Tissue Eng,2006,12(11):3209-3221.

[3]徐梁,曹德君,劉偉,等.體內構建組織工程腱鞘的初步研究[J].組織工程與重建外科雜志,2008,4(6):308-311.

[4]Hu XQ,Jiang ZH,Liu NF.A novel approach for harvesting lymphatic endothelial cells from human foreskin dermis[J].Lymphatic Research&Biology,2006,4:15-22.

[5]胡學慶,蔣朝華,劉寧飛.人真皮微淋巴管內皮細胞的分離培養與鑒定[J].中華實驗外科雜志,2007,24(3):336-338.

[6]蔣朝華,胡學慶,劉寧飛,等.血管生成素-2在新生淋巴管中的調節作用[J].組織工程與重建外科雜志,2007,3(4):237-239.

[7]Banerji S,Ni J,Wang SX,et al.LYVE-1,a new homologue of the CD44 glycoprotein,is a lymph-specific receptor for hyaluronan[J].J Cell Biol,1999,144(4):789-801.

[8]Partanen TA,Paavonen K.Lymphatic versus blood vascular endothelial growth factors and receptors in humans[J].Microsc Res Tech,2001,55(2):108-121.

[9]Lymboussaki A,Partanen TA,Olofsson B,et al.Expression of the vascular endothelial growth factor C receptor VEGFR-3 in lymphatic endothelium of the skin and in vascular tumors[J].Am J Pathol,1998,153(2):395-403.

[10]Halperin TJ,Slavin SA,Olumi AF,et al.Surgical Management of scrotal lymphedema using local flaps[J].Annals of Plastic Surg,2007,59:67-72.

[11]Langer R,Vacanti JP.Tissue engineering[J].Sci,1993,260:920-926.

[12]Vacanti JP,Langer R.Tissue engineering:the design and fabrication of living replacement devices for surgical reconstruction and transplantation[J].Lancet,1999,354(1):32-34.

[13]蔣朝華,胡學慶,劉寧飛.人真皮淋巴管內皮細胞分離及冷凍保存技術[J].上海交通大學學報醫學版,2007,27(9):1092-1095.

[14]Niklason LE,Gao J,Abbott WM,et al.Functional arteries grown in vitro[J].Sci,1999,284:489-493.