血管瘤動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

麥華明 鄭家偉

血管瘤動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

麥華明 鄭家偉

血管瘤是嬰幼兒最常見的良性腫瘤，典型特點(diǎn)是其生命周期分為3個(gè)階段：增殖階段發(fā)生在1歲左右，以內(nèi)皮細(xì)胞增殖為特點(diǎn)，沒有明確血管結(jié)構(gòu)，管腔內(nèi)紅細(xì)胞不明顯；消退期發(fā)生在1歲時(shí)，可持續(xù)到3～5歲，該階段增殖減慢或停止，血管結(jié)構(gòu)變得明顯，管腔增大；消退完成期在5～8歲，這時(shí)血管被纖維脂肪殘余和毛細(xì)管大小的管腔所替代[1]。通常情況下，血管瘤的預(yù)后良好，但部分兒童的腫瘤會(huì)影響組織和器官功能，甚至可危及生命。血管瘤的研究，從最早的使用雞冠作為簡(jiǎn)單動(dòng)物模型[2]到最新的血管瘤干細(xì)胞移植，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，出現(xiàn)了使用各種技術(shù)建立的血管瘤動(dòng)物模型。盡管目前還未能成功建立完全模擬血管瘤生物學(xué)行為特點(diǎn)的模型，但已有的進(jìn)展為探索血管瘤的發(fā)病機(jī)制和臨床靶向治療奠定了基礎(chǔ)。本文就血管瘤動(dòng)物模型的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 多瘤病毒及基因轉(zhuǎn)錄

小鼠多瘤病毒（Murine polyomavirus，MPyV）是一種小DNA病毒，自1953年被發(fā)現(xiàn)以來，眾多學(xué)者對(duì)其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)它在體外能使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，在小鼠的乳腺、唾液腺、骨、皮膚等器官組織能誘發(fā)多種腫瘤，如血管瘤、癌、肉瘤、淋巴瘤等。其基因的早期序列為重疊基因，編碼3種蛋白質(zhì)，即大T抗原（LT）、中T抗原（MT）和小T抗原（ST），它們具有相同的氨基端。MT被認(rèn)為是病毒的主要癌基因，其編碼的蛋白質(zhì)是由421個(gè)氨基酸組成的膜結(jié)合蛋白，分子量為56 kD，通過疏水的羧基端將其錨著在細(xì)胞膜上，蛋白的大部分位于胞質(zhì)內(nèi)，并具有與磷酸激酶牢固偶聯(lián)的特性，其中在Tyr-250、Tyr-315和Tyr-322處存在3個(gè)酪氨酸位點(diǎn)，可被特異性酪氨酸激酶系統(tǒng)磷酸化。目前認(rèn)為，Tyr315本身的磷酸化是MT抗原引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化表型形成的關(guān)鍵過程，MT通過干預(yù)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制影響細(xì)胞分裂。Bautch等[3]證實(shí)，多瘤病毒中的MT抗原基因?qū)?nèi)皮細(xì)胞特別易感，將其整合到小鼠正常基因序列中，是小鼠罹患血管瘤的根本原因。Sandra等[4]用高濃度的PyV通過腹腔注射入大鼠體內(nèi)，9 d后出現(xiàn)了大腦、皮膚、腹膜的血管瘤，腫瘤生長(zhǎng)快速，伴發(fā)腦出血和貧血，導(dǎo)致大鼠在注射病毒后的3周內(nèi)死亡。徐骎等[5-6]應(yīng)用DNA顯微注射法，將PyMT基因?qū)胄∈笫芫眩⒅踩肽甘筝斅压埽瑥亩鴮yMT基因整合到小鼠DNA正常序列中，得到了主要分布于皮膚和黏膜表面的全身多發(fā)性血管瘤的小鼠動(dòng)物模型，但產(chǎn)仔率低，存活時(shí)間不長(zhǎng)（圖1）。王延安等[7-8]通過PCR方法，從雞的基因組序列中克隆絕緣子元件，構(gòu)建四環(huán)素誘導(dǎo)調(diào)控的條件化轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒，并將其調(diào)控元件和受控元件串聯(lián)成一個(gè)載體，將MT基因亞克隆至此載體，行小鼠受精卵原核注射，獲得轉(zhuǎn)染MT基因陽性小鼠。強(qiáng)力霉素體外誘導(dǎo)部分陽性鼠MT基因表達(dá)，建立了可以傳代的四環(huán)素誘導(dǎo)調(diào)控的MT轉(zhuǎn)基因小鼠模型，但所形成的血管瘤樣病變?yōu)槟倚越Y(jié)構(gòu)，組織學(xué)上更接近靜脈畸形。

圖1 應(yīng)用DNA顯微注射法，將PyMT基因?qū)胄∈笫芫眩瑥亩鴮yMT基因整合到小鼠DNA正常序列中，得到了全身多發(fā)性血管瘤的小鼠動(dòng)物模型

Williams等[9]用將攜帶PyMT的鼠內(nèi)皮瘤細(xì)胞移植到成年小鼠體內(nèi)，能誘導(dǎo)產(chǎn)生血管瘤，發(fā)現(xiàn)瘤體內(nèi)的絕大多數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞來源于宿主。Dubois-Stringfellow等[10]將表達(dá)完整多瘤病毒早期編碼區(qū)的基因轉(zhuǎn)入小鼠，然后形成多發(fā)性血管內(nèi)皮瘤，再將瘤體內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞系提取，培養(yǎng)后注射入小鼠皮下或腹腔，均產(chǎn)生了血管腫瘤，組織學(xué)上符合血管內(nèi)皮瘤或血管瘤，瘤體內(nèi)有出血，還伴有血小板減少、貧血和脾腫大等卡-梅綜合征癥狀。隨著腫瘤的快速生長(zhǎng)，卡－梅綜合征加重，小鼠在3～5周內(nèi)死亡，腹腔內(nèi)注射的死亡時(shí)間更快，在注射1～2周后死亡。Bussolino等[11]將多瘤病毒中T抗原基因轉(zhuǎn)化到小鼠，從形成的內(nèi)皮瘤中培養(yǎng)出能夠穩(wěn)定致瘤的End內(nèi)皮細(xì)胞系列；Vergani等[12]將其植入裸鼠，產(chǎn)生了血管瘤樣病變，由于其成瘤率高，效果明顯，該動(dòng)物模型常被用作藥物作用的研究[13-15]。Sausville等[16]使用重組RCAS/PyMT病毒感染SCL-TVA小鼠，將PyMT轉(zhuǎn)化到小鼠體內(nèi)的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)在小鼠腹膜后、肝、腸、卵巢、子宮等全身多發(fā)性血管瘤形成，但小鼠很快因內(nèi)出血而死亡。據(jù)他們推測(cè)，可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)入PyMT基因后，血管內(nèi)皮祖細(xì)胞向血管瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

但不管使用何種轉(zhuǎn)基因方式，PyMT誘導(dǎo)所形成的腫瘤組織學(xué)特征偏惡性，更接近于血管肉瘤或血管內(nèi)皮瘤。

2 血管瘤組織移植法

Tang等[17]將人快速增殖期血管瘤的組織切片分成96份，按6份/鼠移植到裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)移植存活率為84.4%，在植入后2～4個(gè)月移植組織生長(zhǎng)，然后逐漸消退。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，在植入后早期，細(xì)胞發(fā)生水腫、變性、壞死；大約30 d后，細(xì)胞密度升高，第45天時(shí)開始有絲分裂。在植入2個(gè)月后，移植組織主要由血管瘤組織組成并表現(xiàn)出消退的征象（圖2）。隨后，消退逐漸明顯，移植組織逐漸被纖維脂肪組織替代，其主要的組成細(xì)胞是宿主的內(nèi)皮細(xì)胞。但是，之前的研究結(jié)果卻相反，血管瘤組織單獨(dú)移植到裸鼠1個(gè)月后，所有移植瘤組織都不同程度地變小；90 d時(shí)，部分腫瘤完全吸收，其余均不同程度地變小、硬化、消退。鏡下觀察移植瘤組織，單純腫瘤移植組均呈壞死、吸收，有大量吞噬細(xì)胞、纖維組織及少量小膿灶形成[18]。不同的結(jié)果可能與移植的血管瘤組織的不同增殖活性有關(guān)。他們還發(fā)現(xiàn)，在移植后每周肌注大劑量雌激素1次，1個(gè)月內(nèi)的移植血管瘤組織體積無明顯改變，1～3個(gè)月后體積增大，組織學(xué)表現(xiàn)符合毛細(xì)血管瘤特征[18－19]。該模型的建立，明確了雌激素對(duì)血管瘤的促進(jìn)作用，成功保持了血管瘤的生物學(xué)特征，但尚不能進(jìn)一步地闡明血管瘤的發(fā)生機(jī)制。

圖2 將快速增殖期的人血管瘤組織切片移植到裸鼠皮下建立血管瘤動(dòng)物模型

3 血管生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用

許多研究發(fā)現(xiàn)，在血管瘤組織中，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）等血管生長(zhǎng)因子高表達(dá)；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用VEGF基因表達(dá)治療缺血性疾病如心肌梗塞時(shí)，血管生長(zhǎng)因子的過量表達(dá)會(huì)在局部產(chǎn)生小的血管瘤樣病變[20]。

Gualandris等[21]以反轉(zhuǎn)錄病毒載體，將人bFGF的cDNA轉(zhuǎn)染入小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞系，將細(xì)胞注射入裸鼠后，產(chǎn)生了類似卡波西肉瘤樣的血管化病灶；注射到無血管的兔角膜，可誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)；注射入雞囊胚，則在絨毛尿膜囊形成血管瘤樣病變。

Kitajima等[22]通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在兔肝局部以高表達(dá)的VEGF來研究VEGF165與動(dòng)脈硬化癥的關(guān)系，卻發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因兔肝血竇增大，形成大小不同的血管網(wǎng)，具有彌漫性血管瘤的特征，同時(shí)發(fā)生溶血性貧血、血小板減少癥和脾腫大等卡－梅綜合征類似癥狀（圖3）。許振起等[23]向裸鼠皮下移植重組腺相關(guān)病毒包裝的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hVEGF121）質(zhì)粒，觀察到注射部位腫塊的隆起和變小等與血管瘤相似的變化，成瘤率為100%。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，基因移植處的組織內(nèi)大量新生內(nèi)皮細(xì)胞排列成紊亂的管腔狀結(jié)構(gòu)。

圖3 將顯微注射VEGF165cDNA進(jìn)入兔受精卵，獲得在肝細(xì)胞特異性表達(dá)hVEGF的轉(zhuǎn)基因兔

4 血管瘤干細(xì)胞移植技術(shù)的應(yīng)用

Boye等[24]發(fā)現(xiàn)，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞是無性繁殖的，并表現(xiàn)出增高的生長(zhǎng)和遷移特性。Walter等[25]分析增殖期血管瘤組織切片，發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞的克隆性質(zhì)。大量研究發(fā)現(xiàn)，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞可能來源于同一個(gè)原始干細(xì)胞。2008年，Khan等[26]首次報(bào)道從嬰幼兒血管瘤組織中提取出血管瘤干細(xì)胞（HemSCs），這種干細(xì)胞具有旺盛的增殖活性，將單個(gè)細(xì)胞克隆后，植入裸鼠體內(nèi)，7 d后可形成人類血管，從血管組織提取出干細(xì)胞，植入第2只裸鼠后，能再次形成血管組織。這種形成的血管組織能夠表達(dá)嬰幼兒血管瘤的免疫診斷標(biāo)志物GLUT-1和Merosin；植入2個(gè)月后，血管數(shù)目減少，而脂肪細(xì)胞變得明顯（圖4），證實(shí)血管瘤來源細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成了血管和脂肪細(xì)胞。該研究重建了獨(dú)特的嬰幼兒血管瘤演變過程：形成血管，隨后轉(zhuǎn)變?yōu)橹窘M織，提示干細(xì)胞可能是嬰幼兒血管瘤的來源細(xì)胞。但所形成的血管瘤組織并沒有出現(xiàn)與臨床類似的快速增長(zhǎng)，可能與遺漏了關(guān)鍵的細(xì)胞成分有關(guān)。血管瘤組織中是否存在干細(xì)胞，其作用機(jī)制和調(diào)控機(jī)制等，均有待深入研究。

圖4 采用血管瘤干細(xì)胞建立裸鼠模型

5 其他技術(shù)

Spitsbergen等[15]將致癌物N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍與斑馬魚胚胎或魚苗接觸，誘導(dǎo)了血管瘤、血管肉瘤等一系列間質(zhì)細(xì)胞腫瘤的發(fā)生，但多數(shù)為惡性腫瘤。

Dyck等[28]通過aP2-Cre轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控多形性腺瘤基因1（PLAG1）在小鼠的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在腺體、生殖腺、肩胛區(qū)等富有脂肪組織的部位PLAG1過表達(dá)，導(dǎo)致海綿狀血管瘤樣病變的產(chǎn)生。他們推測(cè)，這可能與PLAG1誘導(dǎo)了胰島素樣生長(zhǎng)因子的信號(hào)有關(guān)。但存在血管管腔粗大、內(nèi)皮細(xì)胞扁平等情況，不符合增殖期血管瘤的特征。

Tan等[29]將人血管瘤組織切片包埋在纖維蛋白凝膠，置于培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，并加入少量無血清緩沖鹽培養(yǎng)液，觀察到血管瘤組織邊緣長(zhǎng)出了微細(xì)的血管，不同階段的血管瘤組織出現(xiàn)血管的時(shí)間不同：增殖期最早，在1～4 d就可觀察到，消退期5～7 d，消退完成期7～12 d。該實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了培養(yǎng)的血管瘤組織保留了在體內(nèi)時(shí)的一些生物學(xué)特性（如內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞的表型和數(shù)目，基底膜的組成，生長(zhǎng)因子的表達(dá)等）。江成鴻等[30]則改進(jìn)了這種方法，降低了凝膠中纖維蛋白原的濃度，并加入10%胎牛血清，同樣觀察到了組織塊邊緣生長(zhǎng)出“枝芽狀”細(xì)小血管。這種模型對(duì)研究血管瘤的細(xì)胞、生化和分子機(jī)制以及藥物的作用機(jī)制有一定價(jià)值，但最長(zhǎng)只能持續(xù)數(shù)周時(shí)間，且需要手術(shù)標(biāo)本的支持。

6 展望

建立一個(gè)理想的血管瘤動(dòng)物模型，對(duì)于研究血管瘤的發(fā)病機(jī)制和藥物作用機(jī)制，從而提高臨床療效，發(fā)現(xiàn)新的治療方法或途徑具有重要作用。然而，目前報(bào)道的大多數(shù)血管瘤動(dòng)物模型都不能模擬血管瘤生長(zhǎng)、消退的自然過程，而且不能表現(xiàn)出類似的組織病理特點(diǎn)。由于人類血管瘤并不發(fā)生在其他物種，進(jìn)一步增加了建立動(dòng)物模型的難度。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，提取出血管瘤干細(xì)胞并移植在裸鼠體內(nèi)，成功再現(xiàn)血管瘤的一些特征，有望成為現(xiàn)實(shí)。

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R732.2

B

1673－0364（2010）02－0114－04

2009年12月18日；

2010年2月26日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.02.016

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科。

鄭家偉。