乙型肝炎疫苗聯合卡介苗素在無或弱應答人群中的免疫效果

狄軍波，陳益平，徐志偉

(溫州醫學院附屬育英兒童醫院 感染科，浙江 溫州 325027)

接種乙型肝炎疫苗是預防和控制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的有力措施。但排除宮內感染的因素，仍有約5%～10%的乙型肝炎疫苗接種者經常規的免疫程序后不產生保護性抗體或抗體水平很低，即無或弱應答，其原因可能與遺傳因素、免疫系統疾病或其他慢性疾病以及疫苗因素等有關。其中遺傳因素特別是與HLA相關的免疫耐受為研究重點[1]。已有研究表明[2]，接種乙型肝炎疫苗后產生無或弱應答的嬰兒其血清白細胞介素-12（IL-12）、白細胞介素-10（IL-10）水平往往明顯低于強應答者，其原因可能與抗原提呈細胞(antigen presenting cells，APC)功能以及共刺激分子的表達低下，導致IL-12、IL-10等細胞因子分泌不足有關。提高疫苗接種時機體的IL-12、IL-10分泌水平可能會提高疫苗接種的成功率。為此，我們觀察了肌內注射卡介苗素對乙型肝炎疫苗接種后無或弱應答的嬰兒在復種疫苗時血清IL-12和IL-10水平的變化及抗體應答情況，探討其作為乙型肝炎疫苗佐劑的價值，現報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 2006年1月至2008年12月溫州醫學院附屬第二醫院產科出生按常規3劑標準程序免疫接種乙型肝炎疫苗的嬰兒（802例），3劑標準程序完成后第8周，定量檢測乙肝表面抗體的幾何平均滴度(geometric mean titer，GMT)，篩選對乙型肝炎疫苗無或弱應答(GMT<100 U/L)的健康嬰兒60例，分為兩組，即觀察組(乙型肝炎疫苗+卡介苗素組)和對照組(單純乙型肝炎疫苗組)各30例。

1.2 研究方法 兩組均按0、1、6方案(每次10μg)重組乙型肝炎疫苗(上海生物制品研究所分裝比利時史克必成公司產品，批號990503)進行再免疫，其中一組同時肌內注射卡介苗素(浙江萬馬藥業有限公司生產，商品名：迪蘇)，每次1 mL，每周2次，共三個月。并在復種疫苗前及每次接種乙型肝炎疫苗后次日采血2 mL，離心后，留取上清1 mL置冰箱待檢。于復種后的第8周，平均年齡（15±0.7）月，以抗-HBs定量法檢測兩組乙肝表面抗體的GMT。

1.3 試劑和儀器 HBV血清標志物放免法定量檢測試劑盒及測定儀(電化學發光，美國羅氏公司提供試劑及測定儀)；人IL-12、IL-10酶標雙抗體夾心法試劑盒(深圳晶美生物工程公司)。

1.4 血清IL-12、IL-10檢測 嚴格按試劑盒說明書操作。

1.5 HBV血清標志物放免法定量檢測 嚴格按試劑盒說明書操作。

1.6 統計學處理方法 采用t檢驗(等方差)或t’檢驗(異方差)和方差分析。

2 結果

2.1 觀察組和對照組的血清IL-12和IL-10水平比較 表1、表2顯示，在復種乙肝疫苗前對觀察組和對照組比較差異均無顯著性(P>0.05)；第一次接種后觀察組和對照組比較差異均無顯著性(P>0.05)；第二、三次復種后，觀察組IL-10水平均較對照組明顯升高，兩組比較差異均有顯著性(P＜0.05)；IL-12水平同樣兩組比較差異均有顯著性(P＜0.05)。

表1 乙肝疫苗復種前、后血清IL-10水平(±s，ng/L)

表1 乙肝疫苗復種前、后血清IL-10水平(±s，ng/L)

與復種前比：*P＜0.05；與對照組比：△P＜0.05；與前一次接種后比：▲P＜0.05

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表2 乙肝疫苗復種前、后血清IL-12水平±s，ng/L)

表2 乙肝疫苗復種前、后血清IL-12水平±s，ng/L)

與復種前比：*P＜0.05；與對照組比：△P＜0.05；與前一次接種后比：▲P＜0.05

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2.2 接種前、后兩組的血清IL-12和IL-10水平比較 由表1、2顯示，每一次復種后兩組的IL-12和IL-10水平均較接種前差異有顯著性(P<0.05)；第二、三次復種后，觀察組的血清IL-12和IL-10水平均較接種前明顯升高，組間兩兩比較差異均有顯著性(P＜0.05)，而對照組復種后組間兩兩比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.3 觀察組和對照組的復種后乙肝表面抗體應答水平比較 由表3顯示，觀察組的乙肝表面抗體應答水平較對照組明顯增高，兩組比較有顯著性差異（t=13.22，P<0.01）。

表3 乙肝疫苗復種后乙肝表面抗體的幾何平均滴度±s，U/L)

表3 乙肝疫苗復種后乙肝表面抗體的幾何平均滴度±s，U/L)

與對照組比：*P<0.05

乙肝表面抗體35.6±6.9 60.3±10.4*組別對照組觀察組

3 討論

在已知免疫應答中，T細胞表面的CD28分子與其配體B7結合，在防止形成免疫耐受方面起重要作用。IL-12和IL-10是重要的免疫調控因子[3]。IL-12是T細胞亞群1型（Th1型）細胞因子，它不僅可促進T細胞生長和Th1細胞分化成熟，增強自然殺傷細胞與巨噬細胞的細胞毒性作用，而且還可促進B細胞的增殖、分泌和合成抗體，促進γ-干擾素等細胞因子的分泌，促進細胞免疫應答；IL-10是調節巨噬細胞的主要因子，主要由Th2細胞產生，調節T細、B細胞、NK細胞等的分化和增殖。它是一種雙抑制的反饋因子，對Th1細胞和Th2細胞增殖有雙向調節作用，IL-10、IL-12的產生水平可能直接影響機體在接受外來抗原刺激時抗體的免疫應答能力。文獻表明乙肝表面抗體產生低下的人群中共刺激分子CD80和CD28表達不足，IL-12和IL-10分泌低下[4]，該人群即使給予多次的疫苗刺激往往也不能使其產生足夠的抗體，國內外研究表明IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ、 GMCSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)均能改善小鼠免疫應答能力，從而顯著增加DNA疫苗誘導抗體產生[5]。

國內外對使用疫苗佐劑增加接種效果的研究結果表明，磷酸鋁、SBAS4(鋁劑+S-O脫酰單磷酰脂質A復合物)等作為乙型肝炎疫苗佐劑，是通過增加免疫原與巨噬細胞的相互作用，增加向T細胞呈遞抗原來增強對疫苗的免疫應答，但由于其常需與基因疫苗聯合，目前未能廣泛應用。上世紀末有學者也曾以GM-CSF作為健康成人乙型肝炎疫苗接種的免疫佐劑，結果提示80μg和250μg的劑量不能起明顯的佐劑作用[6]。卡介苗素其有效成分CpG-ODN2006是目前發現的最強的人特異性CpG序列[7-8]，能誘導多種免疫細胞的活化，它通過調節機體內細胞免疫與體液免疫，刺激網狀內皮系統，激活單核-巨噬細胞功能，增強機體免疫能力，BCG細胞壁上的相關脂多糖能誘導IFN-γ、IL-12產生，促進Th1分化和大量巨噬細胞聚集活化[9]，研究證實，BCG刺激后，T24細胞表面的鐘聲蛋白樣受體(TLR)2和TLR4表達水平以及IL-12的分泌量增加，且隨BCG劑量增加而升高[10]。卡介苗素已被應用于老年慢性阻塞性肺疾病(COPD)的防治[11]，并在抗腫瘤免疫和支氣管哮喘防治中有良好的作用，已被廣泛應用于臨床[12]，但鮮見其作為佐劑與疫苗聯合使用的報道。本組資料中，兩組在每次接受乙肝疫苗刺激后IL-12和IL-10的水平均有升高，較刺激前差異有顯著性，表明兩組T細胞的功能不存在一般的免疫缺陷，這與國外的報道一致[13]。第二、第三次疫苗接種后雖兩組的IL-12和IL-10水平上升，但觀察組上升幅度明顯超過對照組，差異有顯著性，說明經過注射卡介苗素后，機體在接受抗原刺激時產生IL-12、IL-10等細胞因子的能力增加；但是在第一次復種后對照組與觀察組血清IL-12和IL-10的水平相仿，差異不顯著，考慮與卡介苗素使用時間短，尚未發揮作用有關。此外，在疫苗的三次復種過程中，觀察組每次疫苗復種后IL-12和IL-10水平均較前一次遞增，組內比較差異有顯著性，證實IL-12和IL-10的分泌量可隨BCG劑量增加而升高，表明肌內注射卡介苗素可以調節抗體無或弱應答嬰兒的細胞免疫功能，使其IL-10、IL-12等細胞因子分泌增加。在三次復種結束后卡介苗注射組的乙肝表面抗體幾何平均滴度較對照組明顯升高，說明卡介苗素的確能提高嬰兒在再免疫時的抗體應答水平。卡介苗素有望作為一種較好的疫苗佐劑，為提高乙型肝炎疫苗的應答水平開辟新的途徑。

[1]梁爭論.李河民. 接種乙型肝炎疫苗無低應答與HLA關聯的研究進展[J].微生物學免疫學進展,2004, 324(4):54-57.

[2]Velu V, Saravanan S, Nandakumar S, et al. Relationship between T-lymphocyte cytokine levels and sero-response to hepatitis B vaccines[J].World J Gastroenterol,2008,14(22):3534-3540.

[3]Pannekoea Y,Trum JM,Bleker OP,et al.Cytokine omcentrations in seminal.Plasama from subfertile men are not indicative of the presence of ureaplasma urealyticum of Mycoplasma hominis in lower genital tract [J]. Med Microbiol,2000,49(18):697-700.

[4]黃茵, 陳智, 徐承槐,等. 乙肝疫苗無、弱應答與B7-CD28及IL-12、IL-10的相關性[J].免疫學雜,2002,18(6):452-455.

[5]Chow YH, Chiang BL, Lee YL, et al. Development of Th1 and Th2 populations and the nature of immune responses to hepatitis B virus DNA vaccines can be modulated by codelivery of various cytokine genes[J].J Immunol,1998,160(3):1320-1329.

[6]Hasan MS, Agosti JM, Reynolds KK, et al. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor as an adjuvant for hepatitis B vaccination of healthy adults[J].J Infect Dis,1999,180(6):2023-2026.

[7]Hartmann G, Krige AM. Mechanism and function of a newlyidentified CpG DNA motif in human primary B cells[J].J Immunol,2000,164(2):944-952.

[8]Todate A,Suda T,Kuwata H,et al.Muramyl dipeptide2Lysstimulates the function of human dendritic cells[J ]. J Leukoc Biol,2001,70(5):723-729.

[9]周娟.卡介苗在支氣管哮喘防治中的作用及影響因素[J]. 國外醫學:兒科學分冊,2003,30(5):228-230.

[10]Scanga CB, Le Gros G. Development of an asthma vaccine:research into BCG[J].Drugs,2000,59(6):1217-1221.

[11]石峰, 魏全紅.卡介苗素對老年COPD 緩解期的防治作用[J].溫州醫學院學報,2002,32(3):174-176.

[12]李響, 龔志勇, 李虹,等. 卡介苗誘導膀胱癌T24細胞表達鐘聲蛋白樣受體和產生細胞因子的研究[J].中華外科雜志,2004, 42(3):177-181.

[13]Akbar SM, Abe M, Masumoto T, et al. Mechanism of action of vaccine therapy in murine hepatitis B virus carriers: vaccine induced activation of antigen present in gdendritic cells[J].Hepatol,1999,30(5):755-764.