迷走神經(jīng)背核微量注射生長(zhǎng)抑素對(duì)大鼠胰腺內(nèi)神經(jīng)元活性的影響

陳小燕，蔡振寨，滿曉華，王偉忠，李兆申

(1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325027；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433；3.第二軍醫(yī)大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)教研室，上海 200433)

迷走神經(jīng)背核(dorsal motor nucleus，DMN)是重要的內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)核團(tuán)，參與胰腺外分泌功能的調(diào)節(jié)。研究表明，生長(zhǎng)抑素（somatostatin，SS）不是直接通過(guò)迷走傳入神經(jīng)纖維和迷走傳出神經(jīng)纖維發(fā)揮抑制其胰腺外分泌功能的效應(yīng)，而是在中樞發(fā)揮對(duì)胰腺外分泌功能的抑制作用[1]。側(cè)腦室內(nèi)微量注射SS對(duì)甲狀腺素激素（thyrotropin-releasing hormone，TRH）刺激的胰腺外分泌有抑制作用，但是對(duì)基礎(chǔ)胰液分泌沒(méi)有抑制作用[2]。我們先前的研究證實(shí)，DMN微量注射外源性SS對(duì)大鼠胰腺基礎(chǔ)外分泌具有抑制作用[3]。在本研究中，我們采用人工合成生長(zhǎng)抑素八肽——善寧（Sandosta-tin），來(lái)觀察DMN微量注射生長(zhǎng)抑素對(duì)大鼠胰腺內(nèi)神經(jīng)元活性的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器和試劑 健康雄性SD大鼠12只(上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，清潔級(jí)，體重250～300g；立體定向儀、微操縱儀、微量注射儀(日本Narishige公司)；善寧（瑞士諾華制藥有限公司）；2%旁安天藍(lán)（PSB），第二軍醫(yī)大學(xué)生理教研室王偉忠老師饋贈(zèng)；直徑0.7 mm的一次性使用intima-II靜脈留置針（江蘇碧迪醫(yī)療器械有限公司）；兔抗c-fos多克隆抗體（Oncogen公司）；EnvisionTM兩步法免疫組化試劑盒（DAKO公司）；BH-2、BX-50顯微鏡（Olympus公司）；恒流泵HL-2B（上海市清浦滬西儀器廠）；T7014 X 700線CCD彩色攝像機(jī)（美國(guó)）。

1.2 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)步驟 健康雄性SD大鼠12只隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組6只，實(shí)驗(yàn)組6只。其中實(shí)驗(yàn)組DMN微量注射SS，對(duì)照組DMN微量注射人工腦脊液（artificial cerebrospi-nal fluid，aCSF），aCSF的配制采用Yamatomo配方[4]。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食過(guò)夜，自由飲水。以2%氯胺酮腹腔麻醉（60～80 mg/kg），建立外分泌功能研究大鼠模型[5]。通過(guò)紅外線烤燈使大鼠肛溫維持在37 ℃左右，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每半小時(shí)追加一次1/3麻醉劑量的氯氨酮。將大鼠固定于立體定向儀上，用安爾碘消毒后顱部皮膚，切開(kāi)顱頂至背部正中皮膚，去除部分枕骨和小腦，充分暴露延髓背面。瓊脂生理鹽水棉球?qū)?chuàng)面周圍圍成一池狀，池中倒入溫石蠟油。另用安爾碘消毒腹部皮膚后，沿腹正中切口開(kāi)腹，暴露胃及十二指腸、胰腺，在幽門下5 mm和十二指腸、空腸交界處分別置直徑2 mm的塑料管并固定待十二指腸灌注。動(dòng)物穩(wěn)定30 min后，將2根外徑1.0 mm的細(xì)玻璃管拉制成尖端外徑20～30μm的兩管微量注射管，并分別灌入0.4μg/mL的善寧和aCSF，善寧溶于aCSF。兩管微量注射管安裝在注射用的微操縱儀上，通過(guò)微量注射儀注射藥物，注射體積為100 nL，注射時(shí)間為30 s，注射后微量注射管停留在藥物注射部位5 min。DMN的立體定位以延髓閂部（obex）為參考點(diǎn)，向前0.6～0.8 mm，旁開(kāi)0.5～0.6 mm，深度0.5～0.6 mm。微量注射畢以恒流泵HL-2B按3 mL/h的速度向十二指腸內(nèi)灌注20%脂肪乳液1 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將染料2% PSB 50 nL微量注射至藥物注射部位。過(guò)量氯氨酮深度麻醉大鼠，經(jīng)左心室-升主動(dòng)脈插管，先灌注溫生理鹽水100～200 mL，先快后慢。再灌注0.1 mmol/L PBS配制的4%多聚甲醛（4 ℃）350～400 mL，先快后慢，約60～80 min。取胰腺標(biāo)本冰凍切片。并去除顱骨，小心取出完整腦干并放入4 ℃ 4%多聚甲醛中后固定4 h，再移入含30%蔗糖的0.1 mmol/L PBS溶液中，4 ℃過(guò)夜儲(chǔ)存沉底。再進(jìn)行冰凍切片，將延髓作50μm的冠狀切片，1%中性紅染色，在顯微鏡下尋找染點(diǎn)，根據(jù)Paxinos and Watson圖譜[6]，觀察其在延髓中的分布。

1.3 胰腺內(nèi)神經(jīng)元免疫組化染色 胰腺標(biāo)本行冰凍切片（16μm），置入預(yù)冷4 ℃的丙酮固定30 min，室溫自然干燥、復(fù)溫，0.01 mol/L PBS洗3×10 min，置入含1.5% H2O2、20%甲醇、0.2% triton的PBS液室溫孵育20 min，0.01 mol/L PBS洗3×10 min，置入含0.01 mol/L BSA、0.5% triton的PBS液室溫孵育2 h，加c-fos一抗（1∶10000）4 ℃孵育48 h，0.01 mol/L PBS洗3×10 min，加兔二抗（Envision試劑盒）37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗3×10 min，DAB顯色2～3 min，蘇木素襯染3～5 min，酸酒精分化30 s，流水沖洗、藍(lán)化，自然風(fēng)干，中性樹(shù)脂封片，56 ℃烤箱過(guò)夜。陰性對(duì)照：PBS代替一抗、二抗。陽(yáng)性對(duì)照：大鼠腦組織冰凍切片。

1.4 計(jì)算機(jī)圖像分析 彩色病理圖像分析軟件采用IMS型計(jì)算機(jī)彩色圖像分析綜合系統(tǒng)，是華東理科大學(xué)自動(dòng)化研究所和上海醫(yī)科大學(xué)共同研制開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品。在Olympus光學(xué)顯微鏡下用IMS型計(jì)算機(jī)彩色圖像分析綜合系統(tǒng)在每張切片同一結(jié)構(gòu)位置隨機(jī)挑選5個(gè)視野（×200），測(cè)量以下參數(shù)，每張切片測(cè)量3次取其均值：①陽(yáng)性強(qiáng)度均值表示窗內(nèi)免疫反應(yīng)陽(yáng)性強(qiáng)度均值，可以客觀反映免疫陽(yáng)性反應(yīng)的強(qiáng)度。②陽(yáng)性面積表示窗內(nèi)陽(yáng)性免疫反應(yīng)面積，可以客觀反映免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物分布的數(shù)量。③陽(yáng)性比率（%）＝陽(yáng)性反應(yīng)面積/陰陽(yáng)面積和×100%，可以客觀反映陽(yáng)性產(chǎn)物和陰性產(chǎn)物的相對(duì)比率。④陽(yáng)性面積比（%）＝陽(yáng)性反應(yīng)面積/測(cè)量面積×100%，可以客觀反映免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物面積占總測(cè)量面積的百分比。⑤陽(yáng)性指數(shù)（positive index，PI）=陽(yáng)性反應(yīng)面積×陽(yáng)性強(qiáng)度值/測(cè)量面積，是客觀反映免疫反應(yīng)陽(yáng)性強(qiáng)度的總指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

兩組大鼠胰腺及胰島組織內(nèi)均有c-fos陽(yáng)性神經(jīng)纖維分布（見(jiàn)圖1、圖2），但實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較，胰腺內(nèi)c-fos免疫陽(yáng)性神經(jīng)纖維陽(yáng)性強(qiáng)度均值、陽(yáng)性面積、陽(yáng)性比率、陽(yáng)性面積比和陽(yáng)性指數(shù)均明顯降低，各參數(shù)的均值與對(duì)照組相比，差異有顯著性（P<0.05）（見(jiàn)表1）。

圖1 實(shí)驗(yàn)組大鼠胰腺標(biāo)本c-fos免疫組化染色結(jié)果（×200）

圖2 對(duì)照組大鼠胰腺標(biāo)本c-fos免疫組化染色結(jié)果（×200）

表1 c-fos胰腺內(nèi)免疫陽(yáng)性神經(jīng)纖維圖像分析結(jié)果（±s，n=6）

表1 c-fos胰腺內(nèi)免疫陽(yáng)性神經(jīng)纖維圖像分析結(jié)果（±s，n=6）

與對(duì)照組比：*P<0.05，**P<0.01

?

3 討論

胰腺外分泌功能是餐后食物消化吸收過(guò)程的重要組成部分，受神經(jīng)和體液因素（主要為促胰液素與膽囊收縮素）的雙重支配。在胰腺外分泌功能的體液調(diào)節(jié)因素中SS是最強(qiáng)的抑制胰液分泌的激素，其效應(yīng)為劑量正相關(guān)性，它的作用機(jī)制目前尚不清楚。Li等[1]在SD大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，SS是在中樞發(fā)揮對(duì)胰腺外分泌功能的抑制作用。Masuda等[7]發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室注射SS明顯抑制胰腺的外分泌，該效應(yīng)不能被迷走神經(jīng)切斷術(shù)、心得安（β受體阻滯劑）所阻斷，但可以被α受體阻滯劑六烴季銨（hexamethonium）和酚妥拉明（phentolamine）所阻斷。靜脈給予SS模擬側(cè)腦室注射后血液中的SS濃度對(duì)胰腺外分泌功能的抑制效應(yīng)遠(yuǎn)不如前者，兩者差異具有顯著性。這個(gè)實(shí)驗(yàn)亦說(shuō)明SS在中樞發(fā)揮對(duì)胰腺外分泌的抑制效應(yīng)。中樞對(duì)胰腺分泌功能的調(diào)節(jié)主要是通過(guò)DMN發(fā)出的副交感運(yùn)動(dòng)神經(jīng)起作用。免疫組化方法發(fā)現(xiàn)，在迷走神經(jīng)復(fù)合體（dorsal vagal complex，DVC）中廣泛分布SS陽(yáng)性的神經(jīng)元[8]。以往零星的研究發(fā)現(xiàn)，DMN微量注射TRH能刺激胰腺分泌[9]，而胰多肽（pancreatic polypeptide，PP）則能抑制胰腺分泌[10]。腦內(nèi)注射SS、鈣調(diào)基因相關(guān)肽（calcitonin gene-regulated peptide，CGRP）亦對(duì)胰腺分泌有抑制作用[1，11]。但各種中樞神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)胰腺分泌的作用通路，它們對(duì)迷走傳出神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)、對(duì)胰腺內(nèi)神經(jīng)元的調(diào)控，以及特定神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)胰腺分泌的特異性調(diào)節(jié)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。DMN的迷走傳出神經(jīng)對(duì)胰腺分泌的調(diào)控是非常復(fù)雜的，其一方面接受孤束核（nucleus of the solitary tract，NTS）的傳入信息，另一方面也接受高級(jí)中樞的控制[12]，此外，血循環(huán)中一些內(nèi)分泌因素可通過(guò)血腦屏障薄弱處直接作用于DMN[13]。我們認(rèn)為，DMN迷走傳出神經(jīng)對(duì)胰腺功能的調(diào)節(jié)是眾多興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)綜合作用而間接發(fā)揮作用的，迷走神經(jīng)傳出纖維作用于胰腺內(nèi)神經(jīng)，后者綜合各種中樞信息，調(diào)節(jié)胰腺功能。研究發(fā)現(xiàn)DMN迷走傳出神經(jīng)有多種神經(jīng)遞質(zhì)，如乙酰膽堿、NOS及各種神經(jīng)肽（VIP、NPY、GRP）等[14]，因此，我們推測(cè)特定的刺激可以作用于某一組迷走運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，它們有特定的神經(jīng)遞質(zhì)，這些傳出纖維作用于具有不同的特有神經(jīng)遞質(zhì)的胰腺內(nèi)神經(jīng)元，從而調(diào)控不同的胰腺功能。

我們先前的研究[3]表明，DMN微量注射外源性SS對(duì)單位時(shí)間內(nèi)胰液基礎(chǔ)分泌的體積和胰液蛋白質(zhì)分泌量均有顯著的抑制效應(yīng)，其差異有顯著性，證實(shí)DMN在胰腺外分泌功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，外源性SS在DMN發(fā)揮對(duì)胰腺外分泌功能的抑制作用。還有研究發(fā)現(xiàn)[15]，DVC微量注射SS是通過(guò)生長(zhǎng)抑素受體-2發(fā)揮其抑制胰腺外分泌的作用的。但其對(duì)胰腺內(nèi)神經(jīng)元活性影響的研究未見(jiàn)報(bào)道。為了探討迷走神經(jīng)背核SS對(duì)胰腺外分泌功能的調(diào)控及其機(jī)制，本研究采用臨床常用的人工合成生長(zhǎng)抑素八肽——善寧作為中樞微量注射的藥物觀察DMN微量注射SS對(duì)胰腺內(nèi)神經(jīng)元活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰腺內(nèi)c-fos免疫陽(yáng)性神經(jīng)纖維陽(yáng)性強(qiáng)度均值、陽(yáng)性面積、陽(yáng)性比率、陽(yáng)性面積比和陽(yáng)性指數(shù)均明顯減少。其結(jié)果一方面進(jìn)一步證實(shí)DMN在胰腺外分泌功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，另一方面也說(shuō)明外源性SS在DMN發(fā)揮對(duì)胰腺內(nèi)神經(jīng)元的抑制作用，從而對(duì)胰腺外分泌功能發(fā)揮抑制作用。迷走神經(jīng)節(jié)前纖維起源于迷走神經(jīng)背核，到達(dá)胰腺內(nèi)的神經(jīng)節(jié)換元，節(jié)后纖維支配胰腺腺泡細(xì)胞和胰腺導(dǎo)管細(xì)胞，大部分節(jié)后纖維末梢釋放Ach，通過(guò)M受體加強(qiáng)胰腺外分泌功能。一部分節(jié)后纖維是非膽堿能非腎上腺素能的，有的釋放興奮性遞質(zhì)，有的釋放抑制性遞質(zhì)。迷走神經(jīng)背核SS的抑制胰腺外分泌功能的效應(yīng)可能是通過(guò)抑制胰腺內(nèi)迷走興奮性纖維所致。由此我們認(rèn)為，DMN微量注射SS引起的抑制胰腺外分泌功能的效應(yīng)可能是SS抑制了迷走神經(jīng)背核中的膽堿能神經(jīng)元，使迷走神經(jīng)興奮性傳出沖動(dòng)減少，胰腺內(nèi)神經(jīng)元的興奮性沖動(dòng)減少，出現(xiàn)抑制效應(yīng)。本研究進(jìn)一步證實(shí)迷走神經(jīng)背核注射外源性SS抑制胰腺內(nèi)神經(jīng)元的活性，從而發(fā)揮對(duì)胰腺外分泌功能的抑制作用。

進(jìn)一步研究可使用神經(jīng)元活性示蹤物質(zhì)c-fos的免疫組織化學(xué)方法觀察DMN微量注射SS后胰腺內(nèi)膽堿能神經(jīng)元和各種肽能神經(jīng)元活性改變，進(jìn)一步深入了解胰腺外分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制。

[1] Li Y,Owyang C.Somotostatin inhabits pancreatic enzyme secretion at a central vagal site[J].Am J Physiol,1993,265(2Pt1):G251-257.

[2] Masuda M,Kanai S,Miyasaka K.Central somatostatin prevents vagal efferent nerve excitation produced by TRH but not by 2-deoxy-D-glucose[J].Am J Physiol,1997,272(2Pt1):G351-356.

[3] 陳小燕,李兆申,王偉忠,等.迷走神經(jīng)背核微量注射生長(zhǎng)抑素抑制大鼠胰腺外分泌功能[J].中華消化雜志,2007,27(4):268-269.

[4] Okuya S,Yamashita H.Effects of atrial natriuretic polypeptide on rat hypothalamic neurones in vitro[J].J Physiol,1987,389:717-728.

[5] 陳小燕,李兆申,屠振興,等.胰腺外分泌功能研究大鼠模型的建立[J].世界華人消化雜志,2005,13(14):1760-1762.

[6] Paxinos G,Watson C.The rat brain in stereotaxic coordinates[M].4th ed.New York:Academic,1998.

[7] Masuda M,Kanai S,Miyasaka K,et al.Somatostatin inhibits pancreatic exocrine secretion centrally via sympathetic nerves in conscious rats[J].J Auton Nerv Syst,1995,56(1-2):31-37.

[8] Finley JC,Maderdrut JL,Roger LJ,et al.The immunocytochemical localization of somatostatin-containing neurons in the rat central nervous system[J].Neuroscience,1981,6(11):2173-2192.

[9] Okumura T,Taylor IL,Pappas TN.Microinjection of TRH analogue into the dorsal vagal complex stimulates pancreatic secretion in rats[J].Am J Physiol,1995,269(3Pt1):G328-334.

[10] Okumura T,Pallas TN,Taylor IL.Pancreatic polypeptide microinjection into the dosal motor nucleus inhibits pancreatic secrtion in rats[J].Gastroenterology,1995,108(5):1517-1525.

[11] Li Y,Jiang YC,Owyang C.Central CGRP inhibits pancreatic enzyme secretion by modulation of vagal parasympathetic outflow[J].Am J Physiol,1998,275(5Pt1):G957-963.

[12] Li Y,Wu X,Zhu J,et al.Hypothalamic regulation of pancreatic secretion is mediated by central cholinergic pathways in the rat[J].J Physiol,2003,552(Pt2):571-587.

[13] Rogers RC, McTigue DM, Hermann GE.Vagal control of digestion:modulation by central neural and pheripheral endocrine factors[J].Neurosci Biobehav Rev,1996,20(1):57-66.

[14] Wang J, Zheng H, Berthoud HR.Functional vagal input to chemically identified neurons in pancreatic ganglia as revealed by fos expression[J].Am J Physiol,1999,277(5Pt1):E958-964.

[15] Liao Z,Li ZS,Lu Y,et al.Microinjection of exogenous somatostatin in the dorsal vagal complex inhibits pancreatic secretion via somatostatin receptor-2 in rats[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2007,292(3):G746-752.