氫醌對人骨髓單個核細胞TOPO Ⅱα表達的影響及其可能機制

施益芬，俞康，陳怡，任行洲，畢來喜，錢紅蘭

(溫州醫學院附屬第一醫院 血液科，浙江 溫州 325000)

氫醌對人骨髓單個核細胞TOPO Ⅱα表達的影響及其可能機制

施益芬，俞康，陳怡，任行洲，畢來喜，錢紅蘭

(溫州醫學院附屬第一醫院 血液科，浙江 溫州 325000)

目的：觀察苯代謝物氫醌(hydroquinone，HQ)對人骨髓單個核細胞拓撲異構酶Ⅱα（TOPO Ⅱα）表達的影響，探討TOPO Ⅱα在HQ所致造血毒性中的作用及其調控機制。方法：50μmol/L HQ培養10 h的正常人骨髓單個核細胞設為實驗組，等體積滅菌蒸餾水培養10 h為對照組。Western blot測定TOPOⅡα含量的變化，RT-PCR測定TOPOⅡαmRNA表達水平的改變，ChIP技術觀察HQ對骨髓單個核細胞TOPOⅡα啟動子組蛋白乙酰化、甲基化水平的影響。結果：①與對照組相比，人骨髓單個核細胞50μmol/L HQ處理10 h后，TOPOⅡα含量、TOPOⅡαmRNA水平明顯下降，差異有顯著性(P＜0.01）；②TOPOⅡα含量降低伴隨著TOPOⅡα啟動子組蛋白H4乙酰化、組蛋白H3K4甲基化水平的明顯降低(P＜0.01）、組蛋白H3K9甲基化水平升高(P<0.05)，不伴有組蛋白H3乙酰化水平的改變（P＞0.05）。結論：HQ能抑制造血細胞TOPOⅡα的表達；組蛋白化學修飾可能在苯代謝物所致的造血毒性中發揮一定的作用。

氫醌類；拓撲異構酶Ⅱα；組蛋白乙酰化；組蛋白甲基化；染色質免疫沉淀分析

苯是明確的職業致癌物之一。苯誘發的造血系統疾病發病率高。盡管苯所致造血毒性已得到廣泛重視，但其毒性機制仍未闡明。近年來，拓撲異構酶在苯致造血毒性中的作用日益受到關注[1-2]。氫醌（hydroquinone，HQ）是苯在體內的主要代謝產物之一，因此，利用HQ研究苯造血毒性機制，探討拓撲異構酶IIα（TOPOIIα）在HQ所致造血毒性中的作用及其調控機制具有十分重要的意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象正常志愿者捐獻的骨髓20份。志愿者年齡20～35歲，平均27歲，其中男11例，女9例。本研究已通過溫州醫學院附屬第一醫院倫理委員會的認證。所有骨髓捐獻者均簽署知情同意書。1.2實驗材料TOPOIIα檢測試劑盒、兔抗人TOPOIIα抗體（美國TopoGen公司），SuperECL Plus Western Blot超敏發光液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Pierce公司），ChIP assay kit、抗乙酰化組蛋白H3抗體、抗乙酰化組蛋白H4抗體 (美國Upstate公司)，37%甲醛（美國Sigma公司），1，4-氫醌AR（上海凌峰化學試劑有限公司），HQ先以10 mL滅菌雙蒸水溶解，配制成0.1 mol/L的原溶液，滅菌后4 ℃冰箱避光保存。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞培養：取健康志愿獻髓員的骨髓5 mL，肝素抗凝（50 U/mL），淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離制備成單個核細胞懸液。臺盼蘭染色檢測活細胞率，要求拒染率達95%以上。骨髓單個核細胞懸浮培養，調整細胞終濃度為1×106/mL。培養液為體積分數為10%胎牛血清的RPMI-1640培養液。37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養。

1.3.2實驗分組：培養板各孔均加入2×1640液2 mL、胎牛血清液0.4 mL、滅菌雙蒸水1.48 mL、分離制備的骨髓單個核細胞4×106。實驗組加入用滅菌雙蒸水稀釋60倍后的終濃度為50μmol/L的HQ溶液120 μL，對照組加入等量的滅菌雙蒸水(設立平行樣，各實驗組及對照組的標本為同一來源)。培養10 h 后，等滲PBS液洗2遍，調整細胞濃度為1×106/mL備用。1.3.3核蛋白的提取：收集骨髓單個核細胞（3× 107～5×107）（注：因細胞需要量大，標本為多個同組標本收集后混合），加入1 mL冰冷的buffer A（10 mmol/L Hepes，pH 7.9，10 mmol/L KCl，0.1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L EGTA，0.5 mmol/L PMSF），冰上裂解15 min，加入62.5μL質量分數為20% NP-40，劇烈震蕩15 s，10000 r/min離心30 s，核沉淀重懸于50μL冰冷的buffer B(20 mM Hepes，pH 7.9，0.4 M NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L PMSF)，劇烈震蕩15 min，4 ℃15000 r/min 離心5 min，上清液即核蛋白提取液，－70 ℃保存。

1.3.4Western blot分析：參照文獻［3］，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離變性核蛋白100μg，轉膜（生物素化的蛋白Ladder同時電泳轉膜，為評估待測蛋白的分子量提供標準），抗體孵育顯色后分析結果，實驗重復3次。1.3.5RT-PCR檢測：①RNA的提取及cDNA合成：采用Trizol法提取各實驗組及對照組細胞總RNA，采用隨機引物法合成cDNA。②PCR擴增TOPOIIα：上游：5’-TGC CTGTTT AGT CGC TTT C-3’，下游：5’-GGG TCC CTTTGT TTG TTG T-3’，產物349 bp，引物與GenBank基因序列核對無誤，采用β2微球蛋白(上游：5’-ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-3’，下游：5’-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3’，產物115 bp)作為內參照，進行PCR擴增。擴增條件：95 ℃ 10 min預變性，TOPOIIα：95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環后，72 ℃延伸10 min。經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，美國ST公司AlphaImager TM1200型讀膠儀讀取擴增條帶的光密度值進行分析，以目標基因與β2微球蛋白擴增產物的光密度值的比值計算表達水平，實驗重復3次。1.3.6染色質免疫沉淀分析法：ChIP檢測用ChIP分析試劑盒，按產品說明書進行。經預處理的細胞用終濃度為1%的甲酰胺固定10 min，使轉錄因子與DNA交聯，細胞裂解液破膜后，用超聲將DNA打碎成250～1000 bp大小（此處提取的DNA片段命名為input DNA）。用特異性抗體（抗乙酰化組蛋白H3抗體、抗乙酰化組蛋白H4抗體）沉淀DNA-蛋白復合物，用蛋白A瓊脂吸附復合物，經洗去非特異性吸附后，解交聯，沉淀的DNA片段-20 ℃保存備用（此DNA片段命名為ChIPed DNA）。用IgG抗體作為陰性對照，實驗重復3次。

1.4 統計學處理方法采用t檢驗。

2 結果

2.1 HQ對骨髓單個核細胞TOPOIIα含量的影響HQ處理后，TOPOIIα含量較對照組明顯降低，差異有顯著性（P＜0.01），見圖1、表1。

表1兩組TOPOIIα蛋白含量、TOPOIIαmRNA含量的比較（±s，n＝3）

表1兩組TOPOIIα蛋白含量、TOPOIIαmRNA含量的比較（±s，n＝3）

與對照組比：**P<0.01

骨髓單個核細胞對照組實驗組t TOPOIIα蛋白0.983±0.029 0.017±0.029** 41.012 TOPOIIαmRNA 2.833±0.208 0.610±0.128** 15.770

圖1HQ對正常人骨髓單個核細胞TOPOIIα含量的影響(TOPOIIα170 kDa)

2.2 HQ對骨髓單個核細胞TOPOIIαmRNA水平的影響氫醌處理后，TOPOIIα mRNA水平較對照組明顯下降，差異有顯著性（P＜0.01），見圖2、表1。

圖2HQ對正常人骨髓單個核細胞TOPOIIαmRNA水平的影響(TOPOIIα 349 bp，β2-MG 115 bp)

表2HQ對骨髓單個核細胞TOPOIIα啟動子組蛋白乙酰化、甲基化水平的影響（±s）

表2HQ對骨髓單個核細胞TOPOIIα啟動子組蛋白乙酰化、甲基化水平的影響（±s）

與對照組比：*P<0.05，**P<0.01

骨髓單個核細胞對照組實驗組t TOPOIIα啟動子水水平(n＝5) AceH4 1.198±0.056 0.324±0.229** 4.712 AceH3 1.253±0.045 1.177±0.025 2.570 MethH3K4 1.013±0.035 0.54±0.062** 11.443 MethH3K9 0.917±0.015 0.960±0.010* -4.111

2.3 HQ對骨髓單個核細胞TOPOIIα啟動子組蛋白乙酰化、甲基化水平的影響HQ處理后，與乙酰化組蛋白H4、甲基化組蛋白H3K4結合的TOPOIIα啟動子水平明顯降低，差異有顯著性（P＜0.01）；與甲基化組蛋白H3K9結合的TOPOIIα啟動子水平輕度升高，差異有顯著性（P＜0.05）；而與乙酰化組蛋白H3結合的TOPOIIα啟動子水平無明顯改變（P＞0.05），見表2。

3 討論

近年來，苯所致造血毒性已得到廣泛重視，但其毒性機制仍遠未闡明。自1996年Frantz等首次提出，苯的活性代謝產物抑制TOPOII的活性開始，拓撲異構酶在苯致造血毒性中的作用日漸明確。目前認為，苯的代謝產物可導致拓撲異構酶功能失常，繼而導致DNA損傷、誘導細胞凋亡或畸變，最終導致白血病的生成[1-2]。

國內外的研究者就苯的代謝產物對拓TOPOIIα功能的抑制進行了相關的研究，但主要停留在分離純化的人拓撲異構酶系統、白血病細胞株、動物實驗[4-6]等階段。苯的代謝產物能否抑制人骨髓單個核細胞TOPOIIα的功能，目前鮮見報道。我們的前期研究發現體外培養條件下HQ能誘導骨髓單個核細胞凋亡，HQ誘導骨髓單個核細胞凋亡的最佳濃度為50 μmol/L，作用10 h時達高峰[7]，我們觀察正常人骨髓單個核細胞50μmol/L HQ培養10 h細胞凋亡最明顯時TOPOIIα表達的改變。發現正常人骨髓單個核細胞50μmol/L HQ處理10 h后，TOPOII α含量及mRNA表達水平較對照組明顯下降，進一步的臨床苯中毒病人也證實了這一點（數據另文發表），證明HQ能抑制造血細胞TOPOIIα的表達，與國外文獻報道的在分離純化的人拓撲異構酶系統[4]、老鼠原粒細胞株32D.3（G）HQ處理后[5]及老鼠體外實驗觸苯后[6]TOPOIIα的表達變化相符，且更真實完整地反映苯損傷后機體的變化。

表觀遺傳機制的改變導致的基因失活是近年來科學研究的熱點，主要包括組蛋白乙酰化、組蛋白甲基化、DNA甲基化和染色質高級結構中其他成分的修飾。這些修飾改變染色質構型，導致基因轉錄調節發生變化，進而導致細胞增殖失常，最終致癌。有研究發現，人類TOPOIIα啟動子的誘導與組蛋白H4乙酰化緊密相關[8]。本實驗特選用組蛋白特異性抗體，結合ChIP技術來研究TOPOIIα含量變化與組蛋白乙酰化水平改變的關系，探討其可能的機制。我們的研究發現：苯代謝物HQ接觸后人骨髓單個核細胞TOPOIIα表達降低伴隨著TOPOIIα啟動子組蛋白H4乙酰化水平的降低。而組蛋白乙酰化與基因轉錄激活有關，去乙酰化常見基因轉錄沉默[9]。因此，TOPOIIα啟動子組蛋白H4乙酰化水平降低是TOPOIIα表達降低的機制之一。組蛋白除了H4常會發生乙酰化修飾外，H3也是常見的修飾位點，組蛋白H3的翻譯后修飾在轉錄調控及染色質稠密中發揮了重要的作用[10]。本研究發現，TOPOIIα表達降低不伴有TOPOIIα啟動子組蛋白H3乙酰化水平的改變，提示TOPOIIα啟動子組蛋白H3乙酰化水平降低可能不參與TOPOIIα表達的降低。組蛋白H3K4甲基化與基因轉錄活化相關[11]，而組蛋白H3K9甲基化常見基因轉錄沉默[12]。本研究結果顯示，人骨髓單個核細胞苯及其代謝物接觸后TOPOIIα表達降低伴隨著TOPOIIα啟動子組蛋白H3K4甲基化水平的減低、H3K9甲基化水平的升高。說明TOPOIIα啟動子組蛋白H3K4甲基化水平的減低、H3K9甲基化水平的升高亦可能是TOPOIIα表達降低的機制之一。

綜上所述，人骨髓單個核細胞HQ處理后存在著TOPOIIα含量、mRNA表達水平的下降，而TOPOIIα啟動子組蛋白H4乙酰化、組蛋白H3K4甲基化水平的減低、H3K9甲基化水平升高可能是TOPOIIα表達降低的機制之一。下一步，我們將在已成功建立的苯誘發小鼠再生障礙性貧血模型[13]基礎上，進一步研究組蛋白去乙酰化酶抑制劑對TOPOIIα的影響，進一步證實組蛋白化學修飾在苯中毒中的作用，期望研發出苯中毒的特效解毒藥物。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Effect of hydroquinone on expression of topoisomerase enzyme Ⅱαin human bone marrow mononuclear cells and the possible mechanism

SHI Yifen，YU Kang，CHEN Yi，REN Xingzhou，BI Laixi， Qian Honglan.Department of Hematology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325000

Objective: To observe the effects of hydroquinone(HQ)on the expression of topoisomerase Ⅱα(TOPOⅡα)in human bone marrow mononuclear cells，and to explore the possible regulatory mechanism of TOPOⅡαinvolving in the toxicity of HQ to hematopoietic cells. Methods: Human bone marrow mononuclear cells was exposed to 50μmol/L HQ for 10 h(used the cells which were exposed to sterile distilled water for 10 h as control). The expression levels of TOPOⅡα mRNA and protein were detected with RT-PCR technique and Western blot method，respectively. The Chromatin Immunoprecipitation(ChIP)assay was carried out to study the possible mechanism of TOPOⅡα expression changes. Results:The protein and mRNA expression of TOPOⅡα after treated with HQ for 10 h were significantly lower than that in the control(P＜0.01）. The decreased content of TOPOⅡα was associated with descended level of histone H4 acetylation(P＜0.01），H3K4 methylation(P＜0.01）and heightened level of H3K9 methylation of TOPOⅡα promoter(P<0.05)than that in the control with the significant difference，but without accompanied with descented level of histone H3 acetylation（P＞0.05）. Conclusion:HQ can repress the expression of TOPOⅡα in human bone marrow mononuclearcells. The changes of histone chemical modification play definite important role in the benezen’s hematopoietic toxicity.

hydroquinone；TopoisomeraseⅡα；histone acetylation；histone methylation；Chromatin immunoprecipitation (ChIP)

book=3,ebook=3

R135.1+2

A

1000-2138 (2010)02-0164-04

2009-05-20

溫州醫學院重大科研課題B類（2005yxy116）。

施益芬（1981-），女，浙江溫州人，碩士。

俞康，主任醫師，教授，碩士生導師，Email: yukang62@126.com。