自發(fā)性高血壓大鼠視網(wǎng)膜微血管稀少與細胞凋亡

黃曉燕，陳碧新，高瞻，張明英，王賽斌，楊德業(yè)

(溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，溫州醫(yī)學院 心血管生物和基因研究所，浙江 溫州 325000)

在我國高血壓病人群中，高血壓性視網(wǎng)膜病變的陽性率為70%左右，其所致眼底血管的改變基本上與高血壓3個時期的變化相一致，在一定程度上能反映體內(nèi)動脈的情況，對判斷高血壓病的嚴重程度和預后有一定的價值[1]。有關高血壓性視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制尚未明了，其微血管結構改變大多是通過檢眼鏡或眼底熒光素血管造影觀察到的，如江時森等[2]通過墨汁灌注法觀察到自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)視網(wǎng)膜微動脈存在微血管稀少現(xiàn)象，但在這一病理過程中，視網(wǎng)膜微血管病變是否與細胞凋亡有關鮮見報道。近年來，隨著視網(wǎng)膜微血管消化鋪片技術的應用，使直接觀察視網(wǎng)膜微血管的形態(tài)學變化成為了可能。本研究應用視網(wǎng)膜消化鋪片，HE染色直接觀察視網(wǎng)膜微血管的形態(tài)學特征，并對微血管進行定量分析，同時采用TUNEL法特異性標記來觀察13周齡和18周齡SHR視網(wǎng)膜毛細血管細胞凋亡情況，旨在探討細胞凋亡與高血壓視網(wǎng)膜微血管病變的關系。

1 材料和方法

1.1 動物模型和試劑 雄性SHR和正常血壓大鼠（Wistar-Kyoto，WKY）各10只（其中13，18周齡各5只），由上海中科院實驗動物中心提供。大鼠飼養(yǎng)在溫州醫(yī)學院動物中心的標準化飼養(yǎng)房，飲自來水，標準飼料喂養(yǎng)，生活在晝夜節(jié)律為12 h、保持一定溫度和濕度的空間。原位細胞凋亡檢測試劑盒購于美國Roche公司。顯色劑為DAB，購于福州邁新生物技術有限公司。

1.2 血壓測定及眼底拍照 用0.35%戊巴比妥麻醉大鼠后，在安靜狀態(tài)下用計算機化多導生理記錄儀間接測定鼠尾動脈收縮壓，同時在裂隙燈下觀察各組大鼠眼底動脈情況，拍照。

1.3 視網(wǎng)膜血管消化鋪片的制備 過量麻醉處死大鼠，用新鮮配制的4%多聚甲醛心臟灌流固定后摘除眼球，將眼球置于4%多聚甲醛中4 ℃ 24 h。在顯微鏡下自角膜緣后0.5 mm處剪開眼球，去除眼前節(jié)和玻璃體，剝離視網(wǎng)膜，將其放入3%胰蛋白酶溶液內(nèi)，37 ℃孵育2～3 h，消化神經(jīng)組織，然后在蒸餾水中輕輕吹打，僅留一薄層透明的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)，將其貼于潔凈的載玻片上，自然干燥，待染色。

1.4 視網(wǎng)膜血管形態(tài)學改變觀察 將制備好的消化鋪片進行HE染色，光鏡下觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)學改變，各組大鼠選5張切片，每張切片計數(shù)5個高倍視野(×400），應用Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖像，測定視網(wǎng)膜毛細血管面積密度，毛細血管面積密度（%）=毛細血管總面積/視網(wǎng)膜總面積。

1.5 TUNEL標記法 將視網(wǎng)膜消化鋪片按照ROCHE公司提供的TUNEL試劑盒說明書進行原位缺口末端標記檢測。樣本先用0.01 mol PBS緩沖液浸洗2次各5 min后再按照試劑盒說明書進行。陰性對照：用50μL指示液代替TUNEL反應液；陽性對照：實驗前用Dnase-1消化組織（室溫30 min）以打斷所有細胞DNA鏈，余步驟同前；各步驟后均用0.01 mmol PBS緩沖液浸洗樣本5 min×3次。

普通光鏡下觀察細胞凋亡，陽性染色隨凋亡程度的不同呈淺棕至深棕褐色，定位于胞核，根據(jù)下列標準[3]確定著色陽性細胞為凋亡細胞：①單個散在分布；②具有凋亡的核形態(tài)(核固縮或染色質(zhì)濃聚附邊或核碎裂)；③周圍無炎癥反應。對于缺乏凋亡核形態(tài)的陽性細胞，除非染色強度與背景有鮮明對比，且呈單個分布，否則不認為是凋亡細胞[4]。非凋亡細胞呈紫藍色，為陰性。

1.5 統(tǒng)計學處理方法 兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠鼠尾動脈收縮壓變化 13周齡與18周齡SHR收縮壓分別為（148.8±9.9）mmHg、（154.4±17.9）mmHg，WKY分別為（75.9±3.2）mmHg、（75.7±5.9）mmHg，相同周齡SHR組血壓與WKY組比較差異均有顯著性 (P<0.01)，兩組組內(nèi)不同周齡比較，差異均無顯著性(P>0.05)。

2.2 眼底檢查 可見眼底動靜脈由視乳頭分出后呈放射狀，與人眼底不同，無動靜脈交叉，無黃斑結構。對照組眼底未見異常（見圖1），SHR組13周齡和18周齡均可見視網(wǎng)膜動脈變細，管徑不規(guī)則，管壁反光增強，靜脈迂曲擴張，視網(wǎng)膜水腫，反光增強，未見到片狀出血點（見圖2）。根據(jù)Reith-Wagener的4級分類法，相當于高血壓眼底第I、第II級的改變。

圖1 WKY 13周齡眼底血管片

圖2 SHR 13周齡眼底血管片

2.3 視網(wǎng)膜血管形態(tài)學改變 光鏡下，WKY組毛細血管網(wǎng)管徑粗細均勻一致，內(nèi)皮細胞和周細胞均勻分布，內(nèi)皮細胞核呈橢圓形，位于毛細血管中央或稍偏位，較周細胞略大，與血管平行；周細胞核呈短橢圓形、圓形或三角形，位于毛細血管壁的側面，稍突出于血管壁（見圖3）。SHR組血管管徑粗細不均，周細胞和內(nèi)皮細胞分布不均勻，部分毛細血管結構已破壞，13周齡 SHR部分毛細血管閉塞呈細線狀（見圖4），18周齡SHR除了部分毛細血管表現(xiàn)為血管管腔閉塞外，其間無內(nèi)皮細胞及周細胞影，血管腔完全閉鎖，即無細胞毛細血管形成（見圖5）。13周齡與18周齡SHR毛細血管面積密度分別為（0.3720±0.0239）、（0.2840±0.0336），WKY分別為（0.5240±0.0422）、（0.4940±0.0207），SHR組毛細血管面積密度顯著低于WKY組（P<0.01），且隨著周齡增加，SHR組毛細血管面積密度逐漸減少（P<0.05）。

圖3 WKY大鼠視網(wǎng)膜鋪片毛細血管(HE，×400)

圖4 SHR 13周齡視網(wǎng)膜鋪片毛細血管(HE，×400)

圖5 SHR 18周齡組視網(wǎng)膜鋪片可見毛細血管結構已破壞，部分血管未見周細胞和內(nèi)皮細胞(HE，×400)

2.4 視網(wǎng)膜微血管細胞凋亡變化 SHR組大鼠視網(wǎng)膜微血管可見TUNEL陽性細胞，且18周齡陽性細胞與13周齡比較明顯增多（見圖6、8），WKY組大鼠視網(wǎng)膜微血管未見TUNEL陽性細胞（見圖7、9）。13周齡SHR組每個高倍視野凋亡細胞為（8.8±5.50）個，18周齡SHR組為（19.2±7.08）個，兩組比較，差異有顯著性（P<0.05）。

圖6 SHR 13周齡TUNEL特異性標記（×400）

圖7 WKY 13周齡TUNEL特異性標記（×400）

圖8 SHR 18周齡TUNEL特異性標記（×400）

3 討論

高血壓視網(wǎng)膜病變是高血壓最重要的靶器官損害之一。眼底視網(wǎng)膜血管屬微血管范疇，是全身可以直接在體外觀察的微血管，觀察視網(wǎng)膜微血管的改變將有助于高血壓視網(wǎng)膜病變及其他高血壓靶器官損害的研究。微血管稀少是指高血壓時直徑<40μm微動脈及毛細血管在數(shù)量上的減少[5]。Hutchins等[6]于1974年首次指出微血管稀少是高血壓的重要特征。Pewitt等[7]指出微血管稀少分兩個階段：在早期毛細血管密度降低是功能性的，是由于血管收縮所致的無灌注現(xiàn)象；后期則為器質(zhì)性微血管稀少，即毛細血管的真正關閉，表現(xiàn)為毛細血管數(shù)目在解剖上的稀少，一旦過渡為此階段即被認為是走出了高血壓導致靶器官結構性損害的第一步，而且是不可逆的。早期視網(wǎng)膜毛細血管密度的下降可直接影響交換面積，進而影響組織、細胞的物質(zhì)交換，局部物質(zhì)代謝能力有所下降，出現(xiàn)局部組織細胞的損害，氧分壓降低、缺血和低氧而導致視細胞外節(jié)和節(jié)細胞等結構發(fā)生病理改變，從而形成在高血壓早期即造成高血壓靶器官損害——高血壓視網(wǎng)膜病變[8-9]。

本實驗通過應用視網(wǎng)膜消化鋪片直接觀察視網(wǎng)膜微血管來反映高血壓狀態(tài)下的微血管改變，結果顯示，13周齡及18周齡SHR視網(wǎng)膜毛細血管密度較同期WKY組有明顯下降，出現(xiàn)了微血管稀少，且同時出現(xiàn)血管壁結構的改變，表明SHR大鼠視網(wǎng)膜微血管出現(xiàn)了器質(zhì)性稀少或功能性與器質(zhì)性稀少并存的狀況。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡在微血管稀少方面起一定的作用。血管細胞凋亡是高血壓發(fā)生與發(fā)展的重要細胞學基礎。1995年國外學者Hamet[10]提出，可能是細胞凋亡導致了微血管稀少。Gobe等[11]在建立的一腎一夾Goldblat高血壓大鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，實驗動物心肌小動脈及骨骼肌內(nèi)微血管數(shù)量的明顯減少與血管內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡有關，認為高血壓時細胞凋亡在微血管稀少中扮演了一個重要角色。本研究通過TUNEL染色鋪片觀察到，13周齡和18周齡SHR大鼠均發(fā)現(xiàn)有TUNEL染色陽性細胞，且18周齡SHR組TUNEL陽性細胞與13周齡組比較明顯增多。Kobayashi等[12-13]提出氧化應激促進血管內(nèi)皮細胞凋亡和微血管稀疏，并認為通過應用可透過細胞的過氧化物清除劑進行抗氧化處理可抑制內(nèi)皮細胞凋亡及防止自發(fā)性高血壓大鼠的微血管稀疏。可以誘導微血管細胞凋亡的因素很多，但引起凋亡的機制尚不清楚，尚待進一步研究。

上述結果表明，細胞凋亡可能是促進高血壓靶器官損害---高血壓視網(wǎng)膜病變病程發(fā)展、病情惡化的重要原因之一，在微血管稀少中扮演著重要的角色，是促進高血壓的發(fā)生和發(fā)展的重要細胞學基礎。設法干預凋亡從而減少組織細胞損害是一項重要課題。阻止早期微血管細胞的凋亡，改善微血管稀少，可能為治療高血壓視網(wǎng)膜病變及防治高血壓靶器官損害開辟一條新的途徑。

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