血清半乳甘露聚糖抗原動態檢測對燒傷伴曲霉感染早期診斷的意義

向 軍, 孫 珍, 徐正鵬, 夏俊星, 郇京寧

近年來,大面積燒傷并發侵襲性真菌感染有明顯上升趨勢。侵襲性真菌感染主要與念珠菌和曲霉相關,而曲霉感染比例日益增加。臨床上診斷真菌感染的方法主要由宿主因素、臨床特征、微生物學檢查和組織病理學4部分組成。由于燒傷患者真菌感染的臨床表現不具有特異性,呼吸道和血培養標本真菌培養陽性率低,早期診斷非常困難[1]。半乳甘露聚糖(GM)是曲霉細胞壁上的一種多聚抗原,體內循環中GM檢測較臨床癥狀和影像學異常出現前數天表達陽性,其靈敏度和特異度均可達到80%以上。GM試驗是當前比較標準的用于檢測曲霉的方法,可以作為篩選指標之一,其連續檢測,有助于早期診斷曲霉感染并及時用藥[2]。但目前GM試驗的臨床界值尚未確定。本研究通過早期對大面積深度燒傷患者血清GM的動態檢測,并結合臨床診斷,初步探索燒傷患者曲霉感染的GM界值,為燒傷臨床早期診斷提供依據。

材料與方法

一、研究對象

選擇2008年6月—2009年5月上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院燒傷科住院燒傷患者,以單次檢測吸光度(A)指數＞0.5為入選標準,總計20例男性患者,平均年齡(33±11)歲,燒傷面積40%～95%,燒傷深度均為深度燒傷(深Ⅱ度至Ⅲ度)。所有患者入院后每周采血2次、共3周,共收集血標本120份。

二、方法

(一)血清GM測定 研究患者采血后24 h內離心分離出血清,-20℃凍存。GM測定采用Platelia Aspergillus試劑盒(Bio-Rad公司產品)。具體方法 ：300 μ L 血清與100 μ L 處理液混勻,100 ℃水浴3 min后以10 000 r/min離心10 min,取上清液待測;在96孔板中,每孔加結合液50 μ L和處理后的血清50 μ L(其中4孔為標準參照),封口,37℃水浴90 min,去封口膜,清洗、拍板循環5次,每孔吸干后加入顯色液200 μ L,室溫避光 30 min 后加終止液 100 μ L,在450 nm波長的酶標儀上讀取A指數。

(二)診斷標準 參考2008年歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協作組和美國國立變態反應和感染病研究院真菌病研究組(EORTC/MSG)共識組的診斷標準[3]。確診侵襲性真菌病的診斷標準要求穿刺或活檢獲取無菌組織標本,經顯微鏡檢查發現菌絲或培養出霉。燒傷外科專業侵襲性真菌感染診斷意見參照《現代燒傷治療》[4],主要包括：真菌自燒傷創面侵入,穿透到焦痂下并侵入鄰近活組織;口腔黏膜培養到真菌,同時胃腸道黏膜下感染灶真菌培養陽性而兩者菌種一致者;真菌菌血癥伴有臟器轉移。對大面積深度燒傷患者而言,臨床上無法獲取無菌標本組織,所以我們將檢測對象分3類,擬診病例、疑似病例和非曲霉感染病例。擬診病例：患者至少符合1項宿主因素、1項臨床標準和1項微生物學標準。疑似病例：至少符合1項宿主因素、1項臨床標準,但無微生物學證據。患者定期做創面、氣道分泌物、中段尿和血液的曲霉培養,并行X線胸片檢查。對擬診和疑似病例進行抗真菌藥物治療,并繼續監測血清GM的變化。

(三)統計學分析 以擬診病例和疑似病例為陽性組,非曲霉感染病例為陰性組作四格表分析。GM試驗的靈敏度與特異度、陽性預測值與陰性預測值的計算公式如下：靈敏度(SEN)=a/(a+c)、特異度(SPE)=d/(b+d)、陽性預測值=a/(a+b)、陰性預測值=d/(c+d)。根據GM試驗的 A值,設定0.5、1.0和 1.5共 3個界限,并分單次和連續 2次測定值,分別進行統計。并計算假陽性率[特異度=1-假陽性率=1-b/(b+d)]、假陰性率[靈敏度=1-假陰性率=1-c/(a+c)]。

結 果

一、臨床的診斷結果

根據2008年EORTC/MSG共識組的診斷標準,同時參考燒傷專業的診斷意見,以及患者臨床表現、創面與體液真菌培養、影像學檢查的結果,本研究中有擬診病例3例、疑似病例4例,其余13例則排除曲霉感染。

二、患者GM檢測分布范圍

根據血清GM試驗A指數設定的3個界限：0.5、1.0和1.5,并分單次和連續2次測定值,擬診病例、疑似病例和非曲霉感染病例的GM檢測分布范圍見表1。

表1 血清GM試驗結果分布Table 1.Distribution of GM test results

三、血清GM試驗的統計結果

根據不同評估界限,血清GM試驗的靈敏度與特異度、陽性預測值與陰性預測值的統計結果,見表2。

表2 血清GM試驗的統計結果Table 2.Analysis of sensitivity,specificity,positive and negative predictive values

四、A指數單次≥1.5者與臨床曲霉感染陰性表現

納入研究的20例患者中,單次A指數≥1.5且沒有明確臨床感染跡象者有3例,其中1例單次A指數達1.93。這3例患者均未發現曲霉感染臨床征象,且實驗室、影像學檢查也不支持曲霉感染。根據靈敏度與特異度的統計結果,我們發現A指數單次≥1.5的假陽性率為37%,假陰性率為14%;連續2次≥1.5的假陽性率為 10%,假陰性率為29%。

五、連續檢測GM值與療效的關系

對擬診和疑似的7例患者進行抗曲霉藥物治療,6例有效,1例死亡。在GM的連續監測中發現,死亡患者的血清GM值持續處于高水平,而抗曲霉治療有效的患者血清GM值呈明顯下降趨勢。

討 論

隨著免疫抑制劑、廣譜抗生素等的廣泛應用以及器官移植、導管留置操作的普及,真菌感染的發病率不斷升高。真菌感染主要與念珠菌和曲霉相關,兩者占真菌感染的90%左右,而近期曲霉感染的發生率有穩定上升的趨勢。曲霉感染的臨床表現多樣,其中尤為重要的類型是侵襲性曲霉病。侵襲性曲霉病指曲霉侵入人體組織、血液,并在其中生長繁殖引起組織損害、器官功能障礙和炎癥反應的病理改變及病理生理過程,其特征為曲霉菌絲侵襲血管,需要及時診斷和早期積極有效的應用抗真菌藥物。大面積深度燒傷患者,由于機體免疫力下降、防御功能嚴重受損、長時間使用廣譜抗生素、創面壞死組織的存在等因素,曲霉感染的發生率很高[5]。燒傷后的曲霉感染有其特點[4],首先從有大量壞死組織的創面定植開始,然后穿透焦痂侵入皮下脂肪,侵犯靜脈和淋巴管,進入血液后引起侵襲性感染,并在創面局部引起血栓形成、創面加深、肌肉壞死,對機體危害甚大。一旦發生了侵襲性曲霉感染,抗真菌藥物的療效將會大大降低,導致高病死率[6]。因此,對曲霉感染的早期診斷和及時藥物治療,與患者預后直接相關。

臨床上常用檢驗真菌的方法,包括體液或創面的真菌培養、組織病理學檢查、影像學檢查等,對燒傷患者,臨床意義均不大。創面病理活檢或培養,由于標本不是無菌組織,檢測結果也不能明確診斷。與血液病、腫瘤、肺部疾病并發真菌感染不同,大面積燒傷患者發生真菌感染,臨床征象上一般無特異表現,同時其血象變化、影像學資料包括X線胸片也多數不具備診斷特征,并常為原發病所掩蓋。曲霉的培養結果往往需要等待1～2周,而血培養的陽性率極低,而且陽性者標本污染的可能性較大。即使創面曲霉培養陽性,也無法區分是局部定植、還是侵襲性感染。曲霉病藥物治療的最佳時機在于感染早期,而目前燒傷臨床上,由于診斷方法有限、擔心延誤治療時機等原因,多數患者的抗真菌治療依然只能憑臨床經驗,而經驗性治療的療效僅為40%～50%,往往會造成治療不足或過度治療[7]。

血清學檢測方法是近年來發展較快的能早期檢驗真菌感染手段之一。GM試驗是一種通過酶聯免疫吸附法檢測血清中曲霉半乳甘露聚糖抗原以協助診斷真菌感染的方法,其靈敏度為50%～90%,特異度為80%～90%。這項檢測已被美國FDA和歐洲許多國家批準用于血液、腫瘤等免疫受損者中侵襲性真菌感染的診斷[8]。研究證實,ELISA法檢測GM對診斷曲霉病具有較高的特異度;同時,有2/3患者在臨床癥狀和影像學表現出現之前數天至1周,ELISA法測定的血清GM即可以獲得陽性結果,對高危患者連續動態監測(每周2次)具有早期診斷的價值,并證實監測血清GM含量動態變化同樣有利于治療效果和病情發展的判斷[9]。但問題是其靈敏度報道差異很大,在30%～100%,主要原因之一是所采取的檢測界值不同。目前關于血清GM檢測界值尚存爭論。臨床上常用ELISA法,試劑盒為Platelia Aspergillus。同樣的試劑與方法測定曲霉抗原,不同國家和地區判定的界值尚不統一,歐洲多采用1.0或1.5的界值標準,且連續2次陽性提示血清GM陽性;而2003年美國FDA將界值下調至0.5,雖然靈敏度有一定提高,但是0.5～1.5之間的可疑陽性范圍給診斷帶來很大的差異。血清GM試驗用于燒傷伴曲霉感染的診斷和治療評估還剛起步,對燒傷患者來講,明確其診斷界值十分重要,因此,我們做了這方面的初步探索。在患者人選上,我們把具有宿主高危因素的大面積深度燒傷患者納入本研究;并依據美國FDA的界值標準,將單次A指數＞0.5作為入選條件。

通過對20例、單次A指數＞0.5的大面積深度燒傷患者,每周2次、共3周動態檢測發現：連續2次≥1.0,靈敏度71%,特異度 73%;連續 2次 ＞1.5,靈敏度71%,特異度90%;而相對應地,單次≥1.0,靈敏度86%,特異度 54%;單次＞1.5,靈敏度86%,特異度63%。同時,通過對試驗的陽性預測值、陰性預測值進行統計比較,結合燒傷伴曲霉感染的臨床特點等多方面因素分析,初步發現,對大面積燒傷患者而言,GM試驗陽性值界定為連續2次A指數≥1.5的臨床參考價值較大。本研究還發現,納入研究的患者中,單次A指數＞1.5且沒有臨床感染跡象者有3例,這些患者也沒有曲霉感染實驗室依據,提示有一定的假陽性。假陽性主要見于以下情況：標本被青霉屬、鐮刀霉、毛霉等污染,接受哌拉西林-他唑巴坦、阿莫西林-克拉維酸等青霉素類抗生素治療,許多食物尤其是牛奶制品中含有半乳甘露聚糖,均可引起假陽性。此外,由于曲霉釋放入血漿中的GM不是持續存在而是會被很快清除,成為造成假陰性的原因之一,多次復查可以提高檢出率[10]。血清GM動態檢測還發現,應用抗曲霉的藥物治療后,治療有效患者的GM值呈明顯的下降趨勢,無效者則持續高表達,從而提示GM 的動態檢測,對燒傷曲霉感染患者的治療療效評估有一定意義。

本研究結果提示,動態檢測血清GM抗原水平變化,對于大面積燒傷患者伴曲霉感染的早期診斷具有重要意義,且連續2次血清A指數≥1.5的臨床參考價值較大。由于本研究的樣本量偏小,進一步大樣本的調查、分析是必要的;同時,對于抗真菌治療過程中,GM 值變化對藥物療效的評估價值,也尚需更多的臨床資料和分析。

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