耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌產β內酰胺酶研究

侯盼飛, 應春妹, 汪雅萍, 葉楊芹, 張灝旻

鮑曼不動桿菌是醫院感染的重要病原菌,主要引起醫院獲得性肺炎尤其是呼吸機相關性肺炎、菌血癥、尿路感染和繼發性腦膜炎等。近年來鮑曼不動桿菌的耐藥性呈上升趨勢,尤其是出現了碳青霉烯類抗生素耐藥菌株,給臨床治療帶來很大挑戰。產β內酰胺酶是鮑曼不動桿菌對β內酰胺類抗生素耐藥的重要原因,本課題對80株臨床分離鮑曼不動桿菌對13種抗菌藥耐藥性及產β內酰胺酶進行研究。

材料與方法

一、材料

(一)臨床菌株 收集2009年1月—10月我院分離鮑曼不動桿菌共80株,其中亞胺培南耐藥50株,敏感30株,標本種類包括痰液、引流液、尿液、血液、腦脊液、膿液、咽拭子、膽汁和插管等。所有菌株經VITEK-32細菌鑒定儀(法國生物梅里埃公司)鑒定。

(二)質控菌株 大腸埃希菌ATCC25922。

(三)抗菌藥物 阿米卡星、環丙沙星、左氧氟沙星、頭孢他啶、頭孢西丁、頭孢哌酮、他唑巴坦、舒巴坦、磺胺甲唑-甲氧芐啶、美羅培南和多黏菌素B等抗菌藥物制劑購自上海科佳藥檢器材公司。頭孢吡肟由中美上海施貴寶制藥有限公司惠贈,亞胺培南由默沙東制藥有限公司惠贈,哌拉西林由復旦大學附屬華山醫院抗生素研究所惠贈。

(四)試劑 T aq DNA 聚合酶、10×PCR buffer(含MgCl2)、dNTPs mixture為上海閃晶生物科技有限公司產品。

(五)儀器 PCR擴增儀為美國ABI公司產品,凝膠成像儀為上海天能科技有限公司產品。

二、方法

(一)藥敏試驗 用瓊脂稀釋法檢測80株鮑曼不動桿菌對13種抗菌藥的MIC。實驗方法及結果判斷標準參照CLSI 2009年版。①抗菌藥物配制：抗菌藥物原液均配制成4 000 mg/L,試驗中采用倍比稀釋法稀釋至所需濃度,最終試驗濃度從256～0.0625 mg/L。頭孢哌酮-舒巴坦中頭孢哌酮、舒巴坦的配制比例為2∶1,磺胺甲唑與甲氧芐啶比例為9∶1,哌拉西林-他唑巴坦中哌拉西林濃度從256～0.0625 mg/L,他唑巴坦為4 mg/L。②菌液制備：取培養過夜的純菌落,用生理鹽水調至0.5麥氏單位濁度,再稀釋10倍,取1 μ L用于接種。35 ℃孵育20～24 h,觀察結果。③用WHONT 5軟件分析結果,SAS 8.0軟件進行統計分析。

(二)AmpC酶表型檢測 參照 Coudron等[1]報道的三維試驗方法。①酶粗提物制備：挑取血平皿上已純培養18～24 h的菌落3～5個,接種于營養肉湯中,35℃培養6 h左右,定時混勻,4 000 r/min離心30 min,棄上清液,沉淀物于-80℃和35℃反復凍融8次(每次要凍2 h以上再取出融化),加入0.01 mol/L PBS(pH7.0),4℃10 000 r/min離心20 min,上清液即為酶提取物。②三維試驗：將0.5麥氏單位濃度的大腸埃希菌(ATCC 25922)菌液涂布于MH平皿上,取一頭孢西丁藥敏紙片貼在平皿中心,用無菌刀片在離紙片邊緣5 mm處切一小槽,在小槽內加入50 μ L酶提取物,35℃培養過夜觀察結果。當抑菌圈不完整,小槽近頭孢西丁紙片端與抑菌圈交接處出現向平皿中心擴大的長菌區為AmpC酶陽性,抑菌圈完整者為陰性。

(三)EDTA紙片協同試驗 按照紙片擴散法藥敏試驗操作規程,將細菌配成0.5麥氏單位濃度,均勻涂布在MH瓊脂平皿上,分別貼2張亞胺培南藥敏紙片,2紙片中心相距＞25 mm。在其中1張紙片上滴加500 mmol/L(pH=8.0)EDTA溶液5 μ L。35 ℃培養 20 h觀察結果。亞胺培南+EDTA紙片與單純亞胺培南紙片的抑菌圈直徑之差≥7 mm為金屬酶陽性[2]。

(四)模板制備 從血平皿上挑取3～4個受試菌菌落于生理鹽水300 μ L中,制成細菌懸液,混勻。10 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入無菌雙蒸水300 μ L,混勻。細菌懸液100℃水浴,15 min后離心,12 000 r/min離心2 min,取上清液即為DNA模板。

(五)PCR擴增 總反應體系為 50 μ L,其中10×緩沖液(含 MgCl2)14 μ L,dNTPs(各 2.5 mmol/L)mixture 1 μ L,DNA 模 板 2.5 μ L,上下游 引物(10 μ mol/L)各 0.5 μ L,Taq 酶 0.5 μ L,dH2O 31 μ L。反應條件：94℃預變性5 min,然后94℃變性30 s,54℃復性45 s(OXA-51為52℃復性50 s),72℃延伸1 min,共30個循環,最后72℃延伸7 min。PCR產物經1.2%的瓊脂糖凝膠(含EB)電泳觀察特異性擴增條帶,引物序列見表1。

(六)測序 由上海閃晶分子生物科技有限公司協助完成,結果用基因庫中的Blast程序進行同源分析。

結 果

一、藥敏試驗結果

50株IRAB中MIC50＞128 mg/L的抗菌藥物有阿米卡星、環丙沙星、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢哌酮、頭孢西丁、磺胺甲唑-甲氧芐啶,MIC50在32～128 mg/L的抗生素有美羅培南、頭孢哌酮-舒巴坦、頭孢吡肟、頭孢他啶,MIC50＜8 mg/L的抗菌藥物有左氧氟沙星和多黏菌素B。30株ISAB對頭孢西丁耐藥率最高,MIC50為256 mg/L,MIC50＜8 mg/L的藥物有美羅培南、阿米卡星、頭孢哌酮-舒巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟和多黏菌素B。統計學分析顯示,IRAB與ISAB除對頭孢吡肟、頭孢西丁、多黏菌素B耐藥性較一致外,對其他抗菌藥耐藥性差異均有統計學意義(P＜0.01),見表2。

表1 PCR擴增基因型及引物序列Table 1.The sequences of primers used for PCR

表2 IRAB和 ISAB耐藥性比較(MIC：mg/L)Table 2.Resistance comparison between IRAB and ISAB strains(M IC：mg/L)

二、三維試驗結果

50株IRAB中有42株AmpC表型陽性(84%),30株ISAB中有9株陽性(30%)。

三、EDTA紙片協同試驗結果

80株鮑曼不動桿菌中均未檢測到金屬酶。

四、基因檢測結果

在50株IRAB中OXA-23、AmpC陽性的分別為36株(72%)和45株(90%)。其中OXA-23和AmpC同時陽性的 35株(70%);30株 ISAB中OXA-23、AmpC陽性的分別為4株(13.3%)和20株(66.7%),其中同時陽性的4株(13.3%),見圖1。IRAB與ISAB相比,OXA-23陽性檢出率差異有統計學意義(P＜0.01),而AmpC陽性率差異無統計學意義(P＞0.05),80株細菌中OXA-51均為陽性,未檢測到 OXA-24、OXA-58、IMP-1 、IMP-4、VIM-2基因,見表3。

五、測序結果

將PCR擴增產物純化后進行測序,結果經blast比對,OXA-23、OXA-51和AmpC 與Genbank相關基因同源性分別為100%、99%和99%。

圖1 部分IRAB菌株 AmpC、OXA-51和OXA-23β內酰胺酶基因PCR擴增產物電泳圖FIG.1.Electrophoresis of PCR products for β-lactamase genes AmpC,OXA-51 and OXA-23 in some imipenem-resistant Acinetobacterbaumannii strains

表3 AmpC和OXA型酶基因在鮑曼不動桿菌中的檢測結果Table 3.Distribution of AmpC and OXA genes in Acinetobacter baumannii

討 論

鮑曼不動桿菌廣泛分布于周圍環境和正常人皮膚、呼吸道等部位,是一種重要的條件致病菌,近年來耐藥率逐年升高。尤其是耐亞胺培南菌株的出現,給臨床治療帶來很大挑戰,使許多患者面臨“無藥可治”的困境。本研究對我院臨床分離鮑曼不動桿菌耐藥性檢測發現,亞胺培南耐藥菌株同時對氨基糖苷類、喹諾酮類、頭孢菌素類、磺胺類等抗菌藥耐藥,但仍對多黏菌素B敏感,含酶抑制劑頭孢哌酮-舒巴坦的抑菌效果優于單藥頭孢哌酮。這與2008年CHINET監測的結果基本一致[3]。統計學分析顯示,IRAB與ISAB相比,對頭孢吡肟、頭孢西丁、多黏菌素B耐藥性較一致,對其他抗菌藥耐藥性差異有統計學意義。

產β內酰胺酶是鮑曼不動桿菌對β內酰胺類抗生素耐藥的重要原因之一。按照Ambler分類方法,β內酰胺酶分ABCD 4類。A類酶,主要是超廣譜酶(ESBLs),如SHV、TEM、PER、CTX等。B 類酶,活性位點為2價金屬陽離子,故又被稱為金屬β內酰胺酶(MBLs),對β內酰胺類抗生素具有廣泛的水解作用,目前在鮑曼不動桿菌中發現的B類酶包括 IMP-1 、IMP-4 、IMP-6、VIM-2、VIM-3、SIM-1等[4],但國內對此類酶報道較少。C類酶,即AmpC酶,主要分解第三代頭孢菌素及單環酰胺類,可被氯唑西林、Syn 2190抑制。本研究中,PCR檢測發現45株IRAB、20株ISAB AmpC基因陽性,陽性率分別為90%和66.7%,χ2檢驗表明,差異無統計學意義。結合藥敏試驗結果,我們推測我院AmpC基因的高檢出率可能主要與頭孢菌素類耐藥有關而與亞胺培南耐藥關系不大。與三維試驗結果比較,我們發現共有14株PCR結果陽性而表型陰性的菌株,可能原因是表型檢測靈敏度較低引起的假陰性。D類酶,又被稱為苯唑西林酶[5],是鮑曼不動桿菌耐菌藥機制中研究最多的。根據基因同源性不同,又可分為 4組 ：OXA-23、OXA-24、OXA-51 和 OXA-58。OXA-51廣泛存在于鮑曼不動桿菌中,常被認為是該菌的標志性基因,可引起對苯唑西林、氯唑西林和亞胺培南的天然低水平耐藥。本研究的80株鮑曼不動桿菌中,OXA-51也均為陽性。OXA-23,是目前報道最多的β內酰胺酶,可引起對青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類等多種抗生素耐藥,可被舒巴坦、克拉維酸等抑制。本研究檢測到36株IRAB(72%)、4株 ISAB(13.3%)OXA-23基因陽性,與我們前期研究及其他學者報道基本一致[6-7]。具有OXA-23基因通常對碳青霉烯類抗生素耐藥,但我們研究發現4株OXA-23基因陽性而對亞胺培南敏感的菌株,這4株細菌對頭孢哌酮、哌拉西林-他唑巴坦、磺胺甲唑-甲氧芐啶均耐藥,對美羅培南中介或耐藥。李蓉等[8]也發現OXA-23陽性而對亞胺培南敏感的菌株,其原因我們還將做進一步研究。統計學分析顯示,IRAB與ISAB的OXA-23陽性率有顯著差異,推測它可能是造成鮑曼不動桿菌對亞胺培南耐藥的重要原因之一。

本組IRAB中OXA-23基因廣泛存在,是導致本院分離的鮑曼不動桿菌對亞胺培南耐藥的重要原因,是否有其他機制參與耐藥尚有待進一步研究。同時提示我們應加強耐藥表型與耐藥機制的研究,嚴格監測、合理使用抗菌藥,以防止耐藥菌株播散。

[1] Coudron PE,Moland ES,Thomson KS.Occurrence and detection of AmpC β-lactamases among Escherichia coli,K lebssiella pneumonie,and Proteus mirabilis isolates at a veternans medical center[J].J Clin Microbiol,2000,38(5)：1791-1796.

[2] 王春新,謝國強,趙琪,等.紙片協同試驗檢測金屬β內酰胺酶細菌[J].中華檢驗醫學雜志,2003,26(10)：634.

[3] 汪復,朱德妹,胡付品,等.2008年中國CHINET細菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志,2009,9(5)：321-330.

[4] Jones RN,Biedenbach DJ,Sader HS,et al.Emerging epidemic of metallo-β-lactamase mediated resistances[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2005,51(2)：77-84.

[5] Brown S,Amyes SG.The sequences of seven class D β-lactamases isolated from carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii from four continents[J].Clin Microbiol Infect,2005,11(4)：326-329.

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[8] 李蓉,李文林,石小玉,等.鮑曼不動桿菌OXA-23型碳青霉烯酶基因的研究[J].中國抗生素雜志,2007,32(7)：123-126.