基質(zhì)金屬蛋白酶3及其基因多態(tài)性對不穩(wěn)定斑塊的預(yù)測意義

石獻(xiàn)斌 潘家義

1 湖南省花桓縣人民醫(yī)院（416400）

2 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院心血管內(nèi)科（410011）

對急性冠狀動脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）的高危人群的準(zhǔn)確識別仍然是個世界性難題。全世界每年約有1900萬人遭受突發(fā)的心血管事件[1]，其中一大部分沒有先兆癥狀[2]，主要原因是由于潛在的冠狀動脈病變并沒有造成嚴(yán)重的冠狀動脈狹窄，限制冠狀動脈供血[3]，但易損斑塊的突然破裂或斑塊潰瘍基礎(chǔ)上血栓形成卻導(dǎo)致了冠狀動脈部分或全部阻塞，這是ACS的主要發(fā)病機(jī)制。因此，減少心血管突發(fā)事件成為減少冠狀動脈有關(guān)的致殘率和致死率的關(guān)鍵，而研究者們努力尋找新的生物標(biāo)志物以期能夠敏感預(yù)測到易損斑塊及其可能引起的惡性事件。

血管內(nèi)超聲的問世為識別活體冠狀動脈斑塊提供了良好手段，冠狀動脈斑塊處的動脈重構(gòu)首先由Glagov等在尸檢中作了描敘[4]，隨后在IVUS研究中證實(shí)了冠狀動脈重構(gòu)在易損斑塊的病理生理中有著重要意義[5]。相應(yīng)于增加的斑塊負(fù)荷，正重構(gòu)為血管局部橫截面的代償性增加，負(fù)重構(gòu)為血管局部橫截面積的縮小。更有研究報(bào)道，斑塊破裂區(qū)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)增強(qiáng)[6]，通過其降解細(xì)胞外基質(zhì)而削弱斑塊纖維帽，促進(jìn)斑塊破裂。本研究通過IVUS對冠狀動脈罪犯血管斑塊特征的研究，同時檢測血漿基質(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，MMP-3）水平及其基因型，探討MMP-3水平及其基因型與冠狀動脈重構(gòu)和易損斑塊的特征的關(guān)系，研究二者對冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）患者突發(fā)不良心血管事件的危險(xiǎn)預(yù)測作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象

連續(xù)入選花桓縣人民醫(yī)院住院行介入治療的ACS患者21例和穩(wěn)定型心絞痛（stable angina，SA）患者25例行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）前進(jìn)行IVUS檢查。臨床診斷均符合WHO關(guān)于冠心病及其分型診斷標(biāo)準(zhǔn)；凡有以下特點(diǎn)的患者均未入選：合并風(fēng)濕性心臟病、心肌病、心肌炎、先天性心臟病、曾行冠狀動脈成形術(shù)、卒中、出血性疾病、各個系統(tǒng)炎癥性疾病、3個月內(nèi)有重大外傷手術(shù)史、癌癥、靶病變嚴(yán)重鈣化或嚴(yán)重成角、完全閉塞。

1.2 IVUS檢查

使用Boston Scientific GalaxyⅠ血管內(nèi)超聲儀對罪犯血管進(jìn)行檢查。由兩位不知情的專門從事血管內(nèi)超聲操作和分析的人員按照美國心臟病學(xué)會關(guān)于血管內(nèi)超聲采集、測量和報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)分析錄像資料，具體指標(biāo)包括：血管外彈力膜面積（EEMCSA），最小管腔面積（MLA），斑塊負(fù)荷，重構(gòu)指數(shù)＜0.95為負(fù)性重構(gòu)，0.95～1.05為無重構(gòu)，＞1.05為正性重構(gòu)。

1.3 血MMP-3、血漿高敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）測定

患者于導(dǎo)管室行介入治療前，清晨空腹時采集肘靜脈血，分離血漿－80℃儲存。ELISA方法測定血漿高敏C反應(yīng)蛋白（plasma highsensitivity C-reactive protein，Hs-CRP）及MMP-3的濃度。

1.4 MMP-3的基因多態(tài)性分析

1.4.1 引物設(shè)計(jì)及PCR模板制備

正向引物為5'-GAT TAC AGA CAT GGG TCA CG-3'，反向引物為5'-GAA TTC ACA TCA CTG CCA CC-3'（Gene Works Pty Ltd，SA，Australia）；Chelex-100法制備PCR模板。

1.4.2 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序

按照Taq聚合酶使用說明書配制反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，56℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)，72℃延伸10min。

1.4.3 PCR產(chǎn)物酶切及瓊脂糖凝膠電泳檢測

分別取入選患者及普通人的抗凝全血提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按TaqⅠ限制內(nèi)切酶使用說明書配制反應(yīng)體系，PCR產(chǎn)物酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定帶型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用t檢驗(yàn)或單因素方差分析（ANOVA），分類資料用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者一般臨床資料的比較

患者一般臨床資料在SA組和ACS組基本特征相似，在常規(guī)危險(xiǎn)因素上無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。冠狀動脈造影結(jié)果顯示兩組＞50%狹窄血管數(shù)、最大狹窄率無明顯差異，見表1。

2.2 兩組患者IVUS下罪犯病變特征比較

兩組患者IVUS下罪犯病變特征比較顯示兩組的斑塊負(fù)荷、重構(gòu)指數(shù)、重構(gòu)分類上有明顯差異，ACS組有較高的斑塊面積及重構(gòu)指數(shù)，ACS組的冠狀動脈重構(gòu)以正性重構(gòu)為主，而SA組可見明顯負(fù)性重構(gòu)。兩組的最小腔面積、血管外彈力膜、斑塊面積無明顯差異，見表2。

表1 兩組患者一般臨床資料的比較

表2 兩組IVUS下罪犯血管特征比較

2.3 兩組患者血漿Hs-CRP、MMP-3水平比較

兩組患者血漿Hs-CRP、MMP-3水平比較顯示ACS組循環(huán)Hs-CRP水平明顯高于SA組，兩組的MMP-3水平無明顯差異，見表3。

表3 兩組的血漿Hs-CRP、MMP-3水平的比較

2.4 兩組患者M(jìn)MP-3基因型頻率的比較

兩組患者M(jìn)MP-3基因型頻率的比較顯示SA組有更高的5A/5A基因表達(dá)，ACS組MMP-3基因型更多為5A/6A、6A/6A，兩組有顯著差異，見表4。

表4 兩組患者M(jìn)MP-3基因型頻率的比較[例(%)]

2.5 不同基因型之間罪犯血管超聲表現(xiàn)比較

不同基因型之間罪犯血管超聲表現(xiàn)比較顯示6A攜帶患者有更大的血管外彈力膜面積、斑塊面積、斑塊負(fù)荷及重構(gòu)指數(shù)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示6A等為基因與冠狀動脈重構(gòu)密切相關(guān)，見表5。

3 討 論

穩(wěn)定斑塊通常是指向心性斑塊，纖維帽較厚，脂質(zhì)壞死核心小或無，平滑肌細(xì)胞多而炎性細(xì)胞少，膠原含量占70%以上，不易破裂；易損斑塊多為偏心性斑塊，脂質(zhì)壞死核心大（占斑塊體積的40%），纖維帽薄，尤其在偏心性纖維帽的邊緣（肩部），可見大量炎性細(xì)胞浸潤，平滑肌細(xì)胞少，易于破裂。一系列的人類病理學(xué)及IVUS研究已證實(shí)正性重構(gòu)是動脈粥樣硬化早期過程中的一個合理代償機(jī)制[4]，同時它也與增長的炎性反應(yīng)和斑塊不穩(wěn)定型密切相關(guān)，正性重構(gòu)的罪犯血管多為易損斑塊，和ACS高發(fā)生率相關(guān)[5-9]。

表5 不同基因型之間罪犯血管超聲表現(xiàn)比較

本研究結(jié)果證實(shí)了冠心病患者的冠狀動脈重構(gòu)與臨床表現(xiàn)之間有明確的關(guān)系。ACS組患者的“罪犯”病變處更多地表現(xiàn)為正重構(gòu)和較高的斑塊負(fù)荷，而SA組患者更多地表現(xiàn)為負(fù)重構(gòu)和較小的斑塊負(fù)荷，這與國外文獻(xiàn)報(bào)道基本相符[8]。SA患者的負(fù)重構(gòu)發(fā)生率較高，提示纖維化、管腔縮小與負(fù)重構(gòu)的密切關(guān)系有雙面效應(yīng)，既加重管腔狹窄，又減少發(fā)展為ACS 的傾向。而ACS患者病變血管的高正重構(gòu)率和高斑塊負(fù)荷提示易損斑塊與患者日后的不良心血管事件相關(guān)。但是暴露于同樣的危險(xiǎn)因子，有些個體傾向于發(fā)展為纖維鈣化較多的負(fù)性重構(gòu)而另一些卻發(fā)展為斑塊負(fù)荷較重、臨床表現(xiàn)極不穩(wěn)定的正性重構(gòu)的真正原因目前尚不明確。本研究還以一個新視角來探討MMP-3和冠心病患者臨床表現(xiàn)之間的關(guān)系，提出了MMP-3的基因多態(tài)性與血漿MMP-3水平升高、斑塊及血管形態(tài)及ACS易感性有關(guān)，用基因機(jī)制解釋了斑塊負(fù)荷增加的冠狀動脈正性負(fù)荷及其與不穩(wěn)定臨床表現(xiàn)之間的聯(lián)系。

本研究觀察到MMP-3 6A基因攜帶者及ACS患者有較高的循環(huán)MMP-3、Hs-CRP水平。MMP-3又稱基質(zhì)細(xì)胞溶解酶1，是MMPs家族中重要成員之一，在激活狀態(tài)下可以降解Ⅱ、Ⅳ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ型膠原、層粘蛋白、彈性蛋白等，而Ⅳ型膠原是動脈粥樣硬化斑塊基底膜和纖維帽的重要組成部分，它的減少引起了斑塊的不穩(wěn)定。除了能夠降解上述底物，被纖溶酶水解激活的MMP-3還可以激活其他幾種MMPs[10,11]，如MMP-1、MMP-8、MMP-9，使MMPs和金屬蛋白酶組織抑制劑之間的平衡傾向于蛋白水解，從而在血管和心臟的基質(zhì)重構(gòu)中起重要作用。本研究數(shù)據(jù)同樣顯示MMP-3 6A等位基因攜帶者有較高的斑塊負(fù)荷和重構(gòu)指數(shù)，顯示MMP-3 6A等位基因能夠促進(jìn)MMP-3表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)冠狀動脈罪犯血管正性重構(gòu)。這和目前研究一致[12-15]，6A/6A基因與冠心病及頸動脈疾病患者快速發(fā)展的血管狹窄進(jìn)程相關(guān)，其中機(jī)制主要是6A等位基因促進(jìn)動脈壁MMP-3的高表達(dá)，引起微小斑塊破裂、血栓形成，從而促進(jìn)斑塊的不斷生成[16,17]。

總之，本研究認(rèn)為6A等位基因可能促進(jìn)MMP-3的合成，影響冠狀動脈病變血管重構(gòu)及斑塊的穩(wěn)定型，可能為冠心病患者不良心血管事件的一個預(yù)測因子。

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