響應面分析法優化雞腿菇多糖的提取工藝

張東亮 王 薇 吳巧鳳*

浙江中醫藥大學藥學院（310053）

雞腿菇，學名毛頭鬼傘（Copyinds Comatus），又名刺蘑菇、雞腿蘑，因形如雞腿，營養豐富，肉質肉味如雞絲而得名。目前它已被定為符合聯合國糧農組織（FAO）和世界衛生組織（WHO）要求的集“天然、營養、保健”3種功能為一體的16種珍稀食（藥）用真菌之一[1]。現代藥理研究表明，雞腿菇有效活性成分多糖具有降血糖、調血脂、抑菌、抗氧化，提高免疫力、抗腫瘤等多種生理活性作用[2-5]，因此對雞腿菇資源的開發具有重要意義。目前雞腿菇多糖多采用熱水浸提[6]，超聲波[7]或微波輔助提取[2]等方法，但仍以工藝簡單，多糖提取率較高的統熱水浸提的方法為主[3,6,8]。本試驗旨在利用響應面分析法[9-11]，優化雞腿菇多糖的熱水浸提工藝。

1 儀器和試藥

儀器：S22PC可見分光光度計（上海棱光技術有限公司）；R-201旋轉蒸發器（上海申勝生物科技有限公司）；HH-S型水浴鍋（鞏義市英峪于華儀器廠）；SHZ-D循環水式真空泵（鞏義市英峪于華儀器廠）。

試藥：雞腿菇干品產自浙江省麗水市，經浙江中醫藥大學藥學院資源教研室俞冰副教授鑒定為Copyinds Comatus。葡萄糖標準品由中國藥品生物制品檢定所提供（批號110833-200503），其他試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 雞腿菇多糖的含量測定[12,13]

2.1.1 標準品溶液和供試品溶液的配制

標準品溶液：精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標準品1.0010g，入100mL容量瓶中并加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻得葡萄糖標準品儲備液。從中移取1mL溶液加蒸餾水稀釋，定容于100mL容量瓶中得濃度為0.1mg/mL的葡萄糖標準品溶液。

供試品溶液：分別準確稱取雞腿菇干品15份，每份5.0g，加20倍量80%乙醇于80℃水浴加熱回流，趁熱抽濾，反復3次，每次2h，殘渣以熱水浸提得雞腿菇多糖溶液（具體操作步驟見表1和表2中的因素和水平），趁熱抽濾，反復3次，合并濾液，濃縮后定容于100mL容量瓶，即得供試品溶液。

2.1.2 線性關系的考察

精密吸取葡萄糖標準品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于25mL比色管中，各加蒸餾水補至1mL，再各加5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0mL，渦旋混勻后，冷卻30min至室溫后，以蒸餾水為空白對照，在490nm波長處于分光光度計上分別測定吸光度，得吸光度Y與濃度X的回歸方程：Y=6.8271X＋0.0695，相關系數R=0.9994，表明葡萄糖在0～0.1mg/mL濃度范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.3 精密度試驗

取葡萄糖標準品溶液 1mL，置于 25mL比色管中，其余操作按“2.1.2”項下方法進行。平行測定6次吸光度，結果RSD為0.93%，表明儀器的精密度良好。

2.1.4 穩定性試驗

取供試品溶液1mL，定容于25mL容量瓶中，移取1mL溶液置于25mL比色管中，其余操作按“2.1.2”項下方法進行。分別于10、20、30、40、50、60min后測定吸光度，結果RSD為0.86%，表明在1h內吸光度穩定，故多糖含量測定應在顯色后應在1h內完成測定。

2.1.5 加樣回收率試驗

取已知含量的供試品溶液9份，分別加入3個水平的葡萄糖標準品溶液，定容于25mL容量瓶中，從中移取1mL入25mL比色管中，其余操作按“2.1.2”項下方法進行，測定吸光度，計算加樣回收率，9次加樣回收率平均值為99.0%，RSD為2.94%，表明本測定方法可靠。

2.1.6 多糖的含量測定

分別移取供試品溶液各1.0mL，蒸餾水定容于25mL容量瓶，搖勻后各取1mL，置于25mL比色管中，其余操作按“2.1.2”項中方法進行，并在490nm波長處于分光光度計上測定吸光度，由回歸方程計算多糖含量。結果見表2。

2.2 雞腿菇多糖的提取工藝研究

2.2.1 響應面分析法因素的選取及方案分析

分別準確稱取雞腿菇干品5.0g，按“2.1.2”項下方法預處理得殘渣，后根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理，綜合相關單因素實驗數據，選取提取溫度、料液比、提取時間3個因素，采用SAS（SAS Package Veion 9.1.3）對數據進行回歸分析。以雞腿菇多糖提取率作為響應值（Y）。方案及試驗結果見表1和表2。

表1 響應面試驗因素考察表

2.2.2 試驗結果分析

采用SAS 9.1.3軟件對表2的結果進行響應面回歸分析，得擬合方程：Y=3.097442 + 0.244976X1- 0.070011X2+0.217385X3- 0.176271X1×X1+0.14432X1×X2- 0.030004X1×X3- 0.202157X2×X2+ 0.003289X2×X3-0.12838X3×X3，對回歸方程進行顯著性檢驗和方差分析，結果見表3。

表2 響應面試驗安排及結果

表3 回歸方程的顯著性檢驗及方差分析結果

由表3可知，在置信區間95%時，線性相關系數為98.65%.可見回歸方程具有較高的顯著性，可用于替代試驗點對實驗結果進行分析，并進一步對回歸方程各項進行顯著性檢驗，見表4。

表4 回歸方程各項的顯著性檢驗結果

由表4可知，方程一次項、二次項、交互項對提取率影響都具有顯著性差異。由此可見，各具體實驗因素對響應面值的影響非簡單的線性關系。同時做出等值線圖和響應面圖（圖1～6），進行分析計算后得出理論最佳提取工藝條件為：提取溫度：76.69℃，料液比：1∶20.19，提取時間：108.15min，在此條件下雞腿菇多糖的理論提取率為26.03mg/g。結合實際生產條件和方差分析結果，確定最佳提取工藝為：加雞腿菇藥材20倍量的水，在77℃溫度提取108min。

2.2.3 驗證性試驗

圖1 y= f1(x1，x2)的等值線（x 3=0）

圖2 y=f1(x1，x2)響應面值(x3=0)

圖3 y=f2(x2，x3)等值線圖(x1=0)

圖4 y=f2(x2，x3)響應面圖（x1=0）

圖5 y=f3(x1，x3)等值線(x2=0)

圖6 y=f3(x1，x3)響應面圖(x2=0)

按照最佳熱水浸提工藝進行驗證性試驗，提取3次，測得靈芝多糖的平均提取率為25.69mg/g，RSD為0.65%。表明該工藝穩定可行。

3 結 論

3.1 響應面分析法（response surface methodology，RSM）是一種優化反應條件和加工工藝參數的有效方法，廣泛應用于化學化工、生物工程、食品工業等方面[14]。它與正交試驗設計法不同，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優點，并能夠通過相應圖尋求在整個區域上因素的最佳組合和響應值的最優值。

3.2 根據響應面分析確定雞腿菇多糖的最佳提取工藝參數：浸提溫度 77℃，料水比 1∶20，浸提時間108min。按照此工藝條件提取雞腿菇多糖的提取率較高，可達 25.69mg/g，試驗值比理論預測值基本吻合，說明建立的數學模型能較好的預測各因素同提取率之間的關系。

3.3 12號試驗表明在浸提溫度 80℃，料水比 1∶20，浸提時間120min條件下，提取率為26.48mg/g，比最佳工藝提取率稍高。但其提取過程中耗能大，且提取時間比最佳工藝長，不適合工業化大生產的需要。因此最終確定雞腿菇多糖的最佳提取工藝參數為：浸提溫度77℃，料水比 1∶20，浸提時間108min，多糖提取率為25.69mg/g。

3.4 雞腿菇作為真菌中的“后起之秀”，因其較高的營養和藥用價值而越來越受到重視。由本文研究及文獻報道可知雞腿菇含有較高的多糖，本文根據生產實際，確定了雞腿菇多糖的熱水浸提的最佳工藝，可為雞腿菇多糖的進一步開發提供科學的實驗依據。

[1]何文.雞腿菇營養價值高開發前景廣闊[J].資源開發與市場,2000,12(4):11-12.

[2]胡梅.雞腿蘑深層發酵技術及及其多糖分離純化的研究[D].武漢:華中農業大學,2006:10-11

[3]吳艷兵,謝荔巖,謝聯輝等.毛頭鬼傘(Coprinus Comatus)多糖的理化性質及體外抗氧化活性[J].激光生物學報,2007,16(4):438-422.

[4]賈蕊,劉風蘭.雞腿菇研究現狀及發展前景[J].食品科學,2006,27(12):890-893.

[5]李師鵬,蘇蕾.雞腿蘑多糖的提取及免疫活性抗腫瘤活性的研究[J].中國商辦工業,2000(1):44-45.

[6]姚毓婧,楊仁智,張勁松等.雞腿菇子實體多糖分離純化工藝及結構研究[J].微生物通報,2007,34(6):1071-1073.

[7]胡濱,張亞雄,邵偉等.液體深層發酵雞腿菇菌絲體多糖分離提取研究[J].化學與生物工程,2004(5):22-23.

[8]吳巧鳳,劉敬娟,陳京等.雞腿菇營養成分分析[J].食品工業科技,2005,26(8):61-163.

[9]劉軍海,黃寶旭,蔣德超.響應面分析法優化艾葉多糖提取工藝研究[J].食品科學,2009,30(2):114-118.

[10]王薇,余陳歡,沈潔等.響應面分析法優化白蘇中總黃酮的超聲提取工藝[J].中藥材,2007,30(12):1586-1589.

[11]吳暉,賴富饒,胡筱波.響應面分析法優化油菜花粉多糖提取工藝的研究[J].食品與機械,2007,23(5):66-69.

[12]李毅,趙淑芝,周淑芳等.天年合劑總多糖的含量測定及薄層色譜鑒別[J].中國藥業,2006,15(1):35-36.

[13]鄒士玉,馬方勵,丁博.苯酚-硫酸法測定“潤和津露”的粗多糖含量[J].中藥材,2007,30 (11):1470-1472.

[14]楊文雄,高彥祥.響應面法及其在食品工業[J].中國食品添加劑,2005(2):68-71.