銀屑病皮損中PKB、NF-κBp65、Bcl-xL的表達及相關性研究

楊 艷 黃振明 張三泉 劉玉梅 朱慧蘭 文海泉

1 廣東省廣州市皮膚病防治所（510095）

2 湖南省長沙市中南大學湘雅二院皮膚科（410011）

銀屑?。╬soriasis）是一種病因復雜的慢性炎癥性皮膚病，發(fā)病機制未明，主要與感染、遺傳、免疫功能紊亂等因素有關。其重要病理特征是角質形成細胞（kiratinocyte，KC）增生，角化過度伴角化不全，真皮有T淋巴細胞浸潤。近來研究表明，細胞凋亡尤其KC的凋亡異常在銀屑病發(fā)病機制中起到了重要作用。為了對其做進一步的了解，我們采用免疫組織化學法研究PKB、NF-κBp65、Bcl-xL在銀屑病表皮中的表達，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

30例銀屑病標本來源于廣州市皮膚病防治所2004至2005年門診和住院患者，已經(jīng)組織病理確診，取材前1個月未系統(tǒng)或外用過糖皮質激素。其中男20 例，女10例，男女比例2∶1。年齡12～76歲，平均（39.40±14.71）歲。病程1個月～23年，平均（6.23±5.65）年。10例正常對照，為無器質性疾患、因外傷等原因手術的患者正常皮膚，男6例，女4例，男女比例3∶2。年齡18～48歲，平均（31.90±9.48）歲。經(jīng)統(tǒng)計學處理，與銀屑病患者組差異無顯著性。對符合上述入選標準者詳細記錄病史資料，進行PASI評分，銀屑病患者組PASI評分1.58～26.59，平均（14.15±7.94）。取軀干或四肢典型皮損，經(jīng)3.33mol/L（10%）福爾馬林固定24h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片4μm厚。

1.2 試劑

濃縮型兔抗人PKB1（工作滴度1∶100）、Bcl-xL多克隆抗體（工作滴度1∶120）購自武漢博士德生物工程公司。濃縮型鼠抗人NF-κBp65單克隆抗體（工作滴度1∶150）、SP-9000免疫組織化學染色試劑盒、濃縮型DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法

采用免疫組織化學SP法檢測銀屑病組皮損及正常對照組皮膚中PKB、NF-κBp65、Bcl-xL的表達，陽性對照為相關試劑公司提供的PKB、NF-κBp65、Bcl-xL的陽性照片，陰性對照為不加一抗。

1.4 結果判斷

采用銀屑病皮損面積和嚴重程度評分法（Psoriasis Area and Severity Index，PASI）對銀屑病患者予以病情嚴重程度評分。免疫組織化學結果陽性信號為棕褐色或棕黃色、淡黃色顆粒，定位于細胞質及細胞膜。將排除了切片或涂片本底因素后的純免疫組織化學顯色反應程度按灰度圖像分析為0（白）至255（黑）個等級，每個等級定義為1個陽性單位（positive unit，PU）。陽性單位測定：用于反映免疫組織化學的顯色強度，從而定量表達免疫組織化學的陽性和陰性反應結果。每例標本隨機取5個200倍視野，以平均值作為該標本PU值進行比較?；颊吆蛯φ战M間PKB、NF-κBp65、Bcl-xL表達的比較采用t檢驗。各組間線性相關性分析采用Pearson's積差法，并進行偏相關分析以了解三者與PASI評分的內(nèi)在線性聯(lián)系，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

1.5 統(tǒng)計學分析

本組資料均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結 果

2.1 PKB、NF-κBp65、Bcl-xL在正常人及銀屑病患者皮損中的表達

在正常皮膚組織角質形成細胞中PKB、NF-κBp65、Bcl-xL均呈現(xiàn)弱陽性或陰性表達，平均PU值分別為（1.28±0.70）、（1.66±0.70）、（1.64±0.76）。銀屑病患者皮損組織角質形成細胞中表皮全層出現(xiàn)不同程度的PKB、NF-κBp65、Bcl-xL表達，均呈棕黃色或棕褐色顆粒狀：其中PKB定位于細胞核核膜或近核膜胞質，平均PU值為（8.40±3.07）；NF-κBp65在靜止細胞中定位于胞質，活化時向胞核移位，平均PU值為（7.45±3.03）；Bcl-xL定位于近核膜胞質，平均PU值為（9.27±3.72）。三者在銀屑病患者組的表達均明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 PKB、NF-κBp65、Bcl-xL在正常人皮膚及銀屑病皮損中的表達（陽性單位，±s）

表1 PKB、NF-κBp65、Bcl-xL在正常人皮膚及銀屑病皮損中的表達（陽性單位，±s）

組別 例數(shù) PKB NF-κBp65 Bcl-xL正常人對照組 10 1.28±0.70 1.66±0.70 1.64±0.76銀屑病組 30 8.40±3.07 7.45±3.03 9.27±3.72 t值 7.225 5.932 6.383 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 銀屑病患者皮損PKB、NF-κBp65、Bcl-xL表達水平和PSAI相關性比較

三者表達水平與患者PSAI評分間均存在正相關，r值分別為0.890、0.866、0.988，P均＜0.01，有統(tǒng)計學意義。

2.3 銀屑病患者皮損PKB、NF-κBp65、Bcl-xL表達水平相關性比較

銀屑病患者皮損PKB和NF-κBp65表達水平間r=0.908，NF-κBp65和Bcl-xL間r=0.921，PKB和Bcl-xL間r=0.915，P均＜0.01。

3 討 論

PKB是1991年發(fā)現(xiàn)的相對分子量約為60×103的具有絲/蘇氨酸蛋白激酶活性的蛋白質，在PI3K等介導的信號轉導途徑中起著關鍵作用[1]。在多種細胞中，PKB充當抗凋亡信號激酶的作用。PKB廣泛產(chǎn)生于各組織。既往研究發(fā)現(xiàn)，致癌基因可能通過磷酸化的PKB來阻斷生理性的細胞凋亡，使細胞失去正常的增殖與分化能力從而導致癌變。有研究提示，在子宮內(nèi)膜細胞中存在有PKB參與的信號轉導途徑來調控細胞的生存與死亡[2]。也有研究提示，PI3K/ PKB抗凋亡信號途徑在調節(jié)心肌細胞生長、心肌肥大和心力衰竭[3]，而在銀屑病的發(fā)病機制中尚無類似報道。我們的研究發(fā)現(xiàn)，正常人角質形成細胞中有PKB的弱陽性表達，而在銀屑病皮損中的角質形成細胞中PKB的表達明顯增強，以表皮中、下層表達更為顯著，差異有統(tǒng)計學意義，而且隨著PASI增高，其表達進一步加強。這表明PKB的過度表達可能與銀屑病的皮損形成存在某種相關性。

NF-κB是一種具有多向性調節(jié)作用的轉錄因子。經(jīng)典的NF-κB是p50/p65亞單位組成的異二聚體。正常情況下，NF-κB結合抑制蛋白IκB以滅活形式存在于胞質中。IκB激酶IKK復合物可磷酸化IκB使其經(jīng)蛋白酶體通路降解進而引起NF-κB激活并轉位入核，結合于抗凋亡基因的啟動子區(qū)激活基因轉錄。NF-κB與細胞凋亡有密切關系。大量研究表明，NF-κB激活能夠阻斷細胞凋亡通路，為保護細胞免于遭受TNF和其它凋亡刺激因子誘導的凋亡級聯(lián)合反應所必需[4,5]。我們的研究結果表明，正常皮膚角質形成細胞中NF-κB呈陰性或弱陽性表達，與正常皮膚相比，銀屑病皮損角質形成細胞中的NF-κBp65表達明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義，且隨著PASI分值增高，表達強度有增加趨勢。表明NF-κB作為核轉錄調節(jié)因子，有可能通過調控各種抗凋亡基因的表達，而參與銀屑病的發(fā)病機制。

細胞凋亡抑制基因Bcl-xL是近年來發(fā)現(xiàn)的Bcl-2基因家族的新成員，作用與Bcl-2相似。目前對Bcl-2基因家族調節(jié)細胞增生和凋亡的機制已有所了解，尤其是與腫瘤的關系日益受到重視，并發(fā)現(xiàn)其很可能是促成某些良性增生性疾病如銀屑病等的重要因素。有人認為BclxL可能與維持角質形成細胞存活，直至終末分化并到達體表才凋亡有關。Nakagawa、 Krajewski、Takahashi等相繼發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損中的角質形成細胞有很高的Bcl-xL表達[6]。這與我們的研究結果相一致。表明Bcl-xL可能作為一種抗細胞凋亡基因參與銀屑病的發(fā)病機制。

我們的研究證實PKB、NF-κBp65、Bcl-xL在銀屑病皮損中表達均增高。從理論上講，PKB直接磷酸化IKKα，使IKK激活，從而調節(jié)NF-κB 活性；Meng等[7]發(fā)現(xiàn)在NIH3T3細胞和內(nèi)皮細胞中，NF-κB亞基p65的表達可通過增加PI3K PDK1的活性促進PKB活化，并在轉錄水平上增加PKB的表達。Mori等[8]運用瞬時轉染分析發(fā)現(xiàn)，TaX（一種病毒蛋白，能抑制凋亡）能激活人類Bcl-xL啟動子活性從而誘導轉活，而敲除人類Bcl-xL啟動子序列的NF-κB結合位點則能顯著減少TaX誘導的轉活。這也證實了NF-κB與Bcl-xL在發(fā)揮抗凋亡作用方面存在某種相關性。活化的PKB直接磷酸化BAD S136殘基后，14-3-3 蛋白阻止BAD 與Bcl-2或Bcl-xL在線粒體結合，同時也阻止Bad和Bcl-2，Bcl-xL在線粒體膜上相互作用[9]，從而使游離的Bcl-xL的表達增加。三者的表達有一定的聯(lián)系，在本研究中初步證實了這一點。我們發(fā)現(xiàn)，PKB與NF-κBp65、PKB與Bcl-xL、Bcl-xL與NF-κBp65的表達均存在相關性，有統(tǒng)計學意義。說明了PKB可能作為抗凋亡信號激酶，激活NF-κB，并引發(fā)其后的一系列抗凋亡效應，銀屑病的發(fā)生可能與三者的共同參與有關。這為進一步明確銀屑病的發(fā)病機制，尋找新的防治靶點提供了新的思路和途徑。

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