生存素在大腸癌中的表達及意義

陳茹芬 楊清緒 李旭艷

1 廣東惠州中心醫院核醫學科（516001）

2 廣東惠州中心醫院病理科（516001）

3 廣東惠州中心醫院檢驗中心（516001）

生存素（survivin）是新近發現的凋亡抑制蛋白（IAP）家族中新的一員,其抗凋亡作用的機制可通過caspase途徑和非caspase途徑實現[1]，是目前人類IAPs家族中研究最多的一個基因。研究已證實多種常見腫瘤如胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、肝癌等均存在survivin異常表達[2]，但在正常成人組織不表達或呈低表達。本文采用RT-PCR法檢測大腸癌及癌旁組織中survivin mRNA表達情況，并探討了生存素的表達與大腸癌臨床病理的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床病例

選取惠州中心醫院2008年8月至2009年11月經病理組織學診斷為大腸腺癌50例（男35例，女15例），平均56.8歲（36～70歲）；術后病理證實乳頭狀腺癌為15例，管狀腺癌為13例，黏液腺癌為15例，印戒細胞癌為7例；按分化程度高分化腺癌25例，中分化腺癌15例，低分化腺癌10例；按Dukes'臨床分期，A期10例，B期22例，C期18例。在手術中采集癌旁組織標本（距腫瘤邊緣5cm處）30例正常大腸組織作為對照。

1.2 檢測方法

1.2.1 主要試劑與儀器

兔抗人survivin多克隆抗體、DAB顯色劑購自福州邁新生物技術開發公司，SP試劑盒購自武漢博士德，Trizol試劑購自Invitrogen公司，survivin基因引物由北京奧克公司合成。紫外凝膠顯像儀（美國），Nikon Eclipse E1000采圖攝像系統（日本）。

1.2.2 RT-PCR法檢測生存素mRNA的表達

①取液氮保存的組織50～100mg，按Trizol說明書提取組織中的總RNA。②cDNA合成 取待測RNA 2μg，100ng/μL隨機引物1μL，加水至20μL，70℃變性5min，冷卻后再加入Moloney小鼠白血病病毒（M-MLV）逆轉錄酶1μL，5×逆轉錄緩沖液8μL，0.1MDTT 4μL，10mmol/L dNTPs 2μL，RNA酶抑制劑（Rnasin）20U，加水至終體積40μL，37℃加熱1h，冷卻后即完成cDNA的合成。③PCR反應：采用50μL的反應體系，其中包括：10×緩沖液，MgCl 21.5～2mmol/L引物各12.5pmol/L，Tag聚合酶1.5U，逆轉錄產物β2微球蛋白為3μL，生存素為5μL。所用β2微球蛋白引物序列：上游引物為5-CTCGC GCTAC TCTCT CTTTC-3’；下游引物為5’-CATGT CTCGT TCCCA CTTAA C-3’，擴增產物大小為330bp。所用生存素的引物序列：上游引物為5’-TTGAA TCGCG GGACC CGTTG G-3’；下游引物為5’-CAGAG GCCTC AATCC AT-GGC A-3’，擴增產物大小為528bp。擴增條件：β2MG 94℃預變性5min，然后94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共擴增28個循環，最后72℃再延伸7min；生存素為94℃預變性5min，然后94℃變性45s，61℃退火45s，72℃延伸1min，共擴增32個循環，最后72℃再延伸7min。所有擴增均在GeneAmp System 9600熱循環儀上進行。擴增產物在含0.5mg/L溴乙錠、20g/L的瓊脂糖凝膠上電泳分離，在凝膠成像儀（VILBER LOURMAT）上對產物掃描，應用分析軟件作相對半定量分析，在同一塊凝膠上以生存素mRNA表達的吸光度值除以β2微球蛋白mRNA表達的吸光度值表示，陽性標準以大于癌旁正常組織產物表達的平均相對值界定。

1.2.3 免疫組織化學檢測組織中survivin蛋白表達

組織經10%中性甲醛液固定，常規石蠟包埋，4μm連續切片，二甲苯脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min，熱抗原修復20min，正常馬血清封閉，室溫孵育10min。1∶200 survivin一抗4℃過夜，PBS洗片5min×3次，滴加生物素標記二抗，辣根過氧化物酶標記鏈霉素卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，脫水、透明、封片。用已知陽性肺癌切片為陽性對照切片，常規抗體稀釋液代替一抗作為陰性對照。

1.3 統計學處理

采用SPSS12..0統計軟件包進行統計學分析，采用，t檢驗、χ2檢驗，P＜0.05為差異有顯著意義。

2 結 果

2.1 survivin在大腸癌和癌旁組織的表達

60例大腸癌組織survivin mRNA陽性表達40例（66.6%）明顯高于癌旁組織2例（6.6%）（χ2=6.85，P＜0.01）。

2.2 免疫組織化學結果

60例大腸癌組織survivin mRNA陽性表達40例（66.6%）明顯高于癌旁組織2例（6.6%）（χ2=6.85，P＜0.01）；且survivin表達與病理分級、有無淋巴結轉移密切相關（χ2=4.25，χ2=4.85，P＜0.01；r=5.12，r=5.32，P＜0.05）；而survivin的表達與性別、年齡、癌組織的病理分型沒有統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 survivin在大腸癌組織中表達與臨床病理參數之間的關系

3 討 論

生存素（survivin）是1997年耶魯大學的Aitieric等[3]在人類基因組庫中首先篩選分離出來的IAP（凋亡抑制蛋白）家族的一個新成員。在胚胎和胸腺組織中豐富表達，在人類大多數腫瘤亦存在高表達。大多數研究均認為，生存素除了在胚胎發育過程中和絕大多數腫瘤組織中表達外，在正常組織中不表達[4]。本研究采用較為敏感的RT-PCR方法檢測大腸癌及癌旁正常組織中生存素mRNA的表達，結果大腸癌組織中陽性表達率（66.6%）明顯高于癌旁正常組織（6.6%），這與Sarela等[5]的研究結果一致，表明生存素是一個較為特異的腫瘤標志物。分析survivin表達與大腸癌的主要參數的關系，發現survivin的表達與性別、年齡、病理類型等無明顯關系，與病理分級、有無淋巴結轉移密切相關。Survivin在病理分級低的組中及有淋巴結轉移組陽性表達率均高于病理分級高的組及無淋巴結轉移組，提示survivin的表達可能會影響大腸癌細胞的生物學特性，使其更容易浸潤周圍組織，發生局部轉移、遠處轉移等惡性行為，也可能是預后不良的指征。生存素mRNA的表達與腫瘤患者的預后相關，這已在非小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌、肝癌中得到證實[6,7]。在大腸癌的研究中，Sarela等[5]的研究表明，在Ⅱ期大腸癌中生存素mRNA陰性表達組患者的5年生存率（94.4%）遠高于陽性表達組（44.8%），提示Ⅱ期大腸癌術后檢測生存素mRNA或生存素蛋白可作為評價大腸癌預后的客觀指標。近來，一些體內、外試驗研究表明[8]，在生存素陽性表達的細胞株或患者中，對化療或放療抵抗現象（chemo-radioresistance）普遍，而封閉生存素的表達則會增加腫瘤對放、化療的敏感性。因此，從臨床角度講，生存素陽性表達的腫瘤患者其治療效果可能不佳，化療耐藥現象可能和一些凋亡抑制基因如生存素有關。

[1]Johnson ME,Howerth EW. Survivin: a bifunctional inhibitor of apoptosis protein[J]. Vet Pathol,2004,41(6):599-601.

[2]Konno R,Yamakawa H,Utsunomiya H,et al. Expression of survivin and Bcl-2 in the normal human endometrium[J]. Mol Hum Reprod,2000,6(6):529-531.

[3]Ambrosini G,Adida C,Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene,survivin,expressed in cancer and lymphoma[J].Nat Med,1997,3(8):917-919.

[4]徐曉,陳衛昌,劉強,等.生存素在大腸癌中的表達及其與血管生成的關系[J].江蘇醫藥,2005,31(6):439-442.

[5]Sarela AI,Macadam RC,Farmery SM,et al.Expression of the antiapoptosis gene,survivin,predicts death from recurrent colorectal carcinoma[J].Gut,2000,46(12):645-650.

[6]Krieg A,Mahotka C,Krieg T,et al.Expression of different survivin variants in gastric carcinomas: first clue to a role of survivin-2B in tumour progression[J].Br J Cancer,2002,86(5):737-743.

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[8]Chakravarti A,Noll E,Black PM,et al.Ouantitatively determined survivmexpression level are prognostic value in human gliomas[J].Clin Oncol,2002,20(4):1063-1068.