間苯三酚法快速測定棉粕中游離棉酚的方法研究

鄭清梅 溫茹淑 韓春艷

棉粕是我國重要的餅粕類蛋白資源，占全國各類餅粕總量的40%以上[1]。棉粕蛋白質含量較高，被廣泛應用于陸生動物和魚類飼料中，是一種具有開發潛力的蛋白質資源。但棉粕中含有游離棉酚（Free Gossypol，FG），具有活性醛基和羥基而有毒性作用，從而制約其在養殖業中的應用[2-6]。因此，棉粕因其棉籽產地、加工等因素影響，導致棉粕中的FG含量有差異。因此，測定棉粕中游離棉酚含量對開發利用棉籽餅粕具有重要意義。

目前已報道的游離棉酚檢測方法主要有：間苯三酚法[7]、高效液相色譜法[8]和苯胺法[9]等。其中苯胺法測定棉酚操作較繁瑣，條件較難控制且苯胺毒性較強，限制了這種檢測方法的應用；高效液相色譜法雖然重現性好、精確度高，但儀器設備昂貴，操作復雜，難以在一般生產企業中推廣應用；間苯三酚法測定游離棉酚所需儀器少，具有操作簡便、條件要求低、回收率高等優點[7]。敖維平等[7]和唐輝等[10]比較了間苯三酚法和高效液相色譜法測定FG的效果，結果表明間苯三酚法與高效液相色譜法測定的結果相近，可用間苯三酚法代替高效液相色譜法測定棉粕中的游離棉酚。

不同的樣品處理方法，對FG的提取量與提取效率有影響。賀秀媛等[11]利用國標測定棉籽餅粕中游離棉酚含量時采用自然浸提的樣品處理方法，浸提時間至少需要12 h。朱雷[12]在測定棉粕中FG時，采用自然浸提法處理樣品需15 h左右，而超聲波法只需10 min。超聲波提取法處理樣品時，由于超聲波的機械破碎和空化作用，能大大縮短浸提時間。敖維平等[7]比較了超聲波與恒溫振蕩兩種樣品提取方法，認為超聲波法效果優于恒溫振蕩法。因此，本試驗分別采用超聲波與恒溫振蕩兩種處理方法，探討浸提時間與溫度兩因素對間苯三酚法快速測定FG的影響，旨在為棉粕企業及養殖場內部質量檢控過程中提供有效方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

主要試劑：99%醋酸棉酚（上海融禾醫藥科技有限公司），間苯三酚（國藥集團化學試劑有限公司）、丙酮（分析純）、苯胺（分析純）、3-氨基-1-丙醇（分析純），其他試劑均為國產分析純。主要儀器：722s分光光度計、2510E-MT超聲波洗滌儀（Branson Ultrasonics Corporation）、HZQ-QG全溫振蕩器。

1.2 方法

1.2.1 棉酚標準曲線的繪制

棉酚標準溶液的配制：準確稱取0.050 g醋酸棉酚，溶于70%丙酮溶液溶解并定容至50 ml作為母液。取此母液用70%丙酮溶液溶稀釋10倍，相當于每毫升應用液中含棉酚0.1 mg。顯色劑配制：準確量取16.6 ml濃鹽酸，置于100 ml三角瓶中，加入1 g間苯三酚，加95%乙醇至100 ml，溶解后混合置于棕色瓶中放入冰箱備用。

準確吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8 ml棉酚標準液并依次編號為1～5號放入10 ml試管中，再依次分別加入1、0.8、0.6、0.4、0.2 ml的 70%丙酮溶液，各試管中加入2 ml的顯色劑，搖勻，在50～55℃恒溫水浴箱中加熱5 min。用1 cm比色皿，以70%丙酮溶液調零，在550 nm波長處測定吸光度值（見表1）。

表1 不同濃度棉酚標準液吸光度值

根據棉酚含量(mg)與吸光度值進行回歸計算，得回歸方程為：y=0.0466x-0.0013(R2=0.9956)，并繪制標準曲線（見圖1）。

圖1 棉酚標準曲線

1.2.2 樣品的處理方法與測定

棉粕用研缽研成粉末并過100目篩后作為樣品，分別以超聲波與恒溫振蕩兩種方法處理，測定在不同的溫度與時間對FG含量的影響。

1.2.2.1 恒溫振蕩法

A：分別準確稱取4～5 g樣品，置于具塞錐形瓶中，分別加入約40 ml 70%丙酮溶液，蓋上瓶塞，于恒溫振蕩器上振蕩 0.5、1、1.5、2、2.5、3、5 h（當時室溫 29℃，轉速120 r/min）。靜置，用中速濾紙過濾于50 ml容量瓶中，丙酮溶液洗滌并定容至50 ml。然后分別取濾液1 ml置于試管中，各加入2 ml顯色劑搖勻，測定方法與標準曲線繪制步驟相同。每個樣品在每一個時間點分別做3個重復，取其平均吸光度值，并根據棉酚標準曲線推算出棉粕樣品中棉酚的含量。

B：分別準確稱取4～5 g樣品，置于具塞錐形瓶中，各加入約40 ml丙酮溶液，蓋上瓶塞，置于恒溫振蕩器上以不同的溫度（20、24、28、32、36、40、50 ℃）振蕩1 h（轉速120 r/min），以下操作步驟同“A”。每個樣品在每一個溫度分別做3個重復，取其平均吸光度值，并根據棉酚標準曲線推算出棉粕樣品中含棉酚的含量。

1.2.2.2 超聲波法

C：分別準確稱取4～5 g樣品，置于具塞錐形瓶中，各加入約40 ml丙酮溶液，蓋上瓶塞，置于超聲波洗滌儀內超聲作用 0.5、1、1.5、2、2.5、3、5 h（29 ℃）。以下操作步驟同“A”。

D：分別準確稱取4～5 g樣品，置于具塞錐形瓶中，各加入約40 ml丙酮溶液，蓋上瓶塞，置于超聲波洗滌儀內以不同的溫度（20、24、28、32、36、40、50 ℃）超聲作用1 h。以下操作步驟同“B”。

1.2.3 國標法測定FG

采用國家標準法測定樣品中游離棉酚的含量，其具體測定方法按GB 13086—91所描述[13]。

2 結果與分析

結果表明，國標法測定棉粕樣品中游離棉酚的含量為361.72 mg/kg。間苯三酚法在浸提時間為1 h，溫度為32℃時，恒溫振蕩法與超聲波法的FG測定值約為372.00 mg/kg（如圖2B所示），與國標法的測定結果相近，但比國標法快速、簡便，穩定性好。

圖2 不同的浸提時間（A）與溫度（B）對間苯三酚法測定棉粕中游離棉酚(FG)含量的影響

不同的浸提時間對間苯三酚法測定棉粕中游離棉酚（FG）含量的影響如圖2（A）所示。浸提時間對恒溫振蕩法與超聲波法提取FG的效果有差異（其浸提溫度均為29℃），但該2種處理方法對FC的提取效果相接近。浸提時間為1 h時，兩種處理方法的提取量均為285 mg/kg左右，浸提時間為1.5 h，其提取量約為305 mg/kg左右，浸提時間為3 h時，其提取量約為322 mg/kg。隨時間的延長，兩種處理方法的FG提取量趨于平穩。

不同的浸提溫度對間苯三酚法測定棉粕中游離棉酚（FG）含量的影響如圖2（B）所示。與浸提時間相比，浸提溫度對間苯三酚法測定FG的影響更為顯著，且恒溫振蕩法和超聲波法對FG的提取量影響的變化趨勢相近。在溫度低于28℃時，恒溫振蕩法和超聲波法的FG提取量均較低，其提取量為281 mg/kg左右。當溫度升高至32℃時，兩種方法的FG提取量均明顯增加，其提取量約為372.65 mg/kg。當浸提溫度高于32℃，其提取量趨于平穩（浸提時間都均為1 h）。

3 小結

本試驗在樣品處理過程中采用超聲波洗滌儀與恒溫振蕩器，這兩種儀器操作簡便且價格較低，能為普通生產或養殖企業所接受。本試驗采用超聲波法和恒溫振蕩法提取游離棉酚，浸提時間1.5 h以后，FG提取量趨于穩定，其適宜浸提時間為1.5～2.5 h。與自然浸提方法相比，大大縮短了FG的浸提時間[11-12]。

當浸提溫度由20℃上升至32℃時，超聲波與恒溫振蕩法的FG提取量均明顯提高（浸提時間1 h）。當浸提溫度高于32℃時，FG的提取量趨于穩定。因此，其適宜浸提溫度為32～36℃，且超聲波法比恒溫振蕩法的處理效果稍好。

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[13]GB/T13086-1991.飼料中游離棉酚的測定方法[S].