α-酮戊二酸對免疫應激仔豬肝臟氨基酸代謝的影響

李永塘 付大波 侯永清 丁斌鷹 劉玉蘭 朱惠玲

在內毒素脂多糖誘導的免疫應激下，為抵抗有害刺激，會導致機體基礎代謝提高、抗體生成上升，氨基酸糖異生的量上升[1]。AKG是谷氨酰胺（Gln）的最佳替代物，可以提高人肌肉內游離谷氨酰胺的水平，應激狀態下可促進肌肉蛋白質的合成[2-3]。已有研究表明，應激會影響機體部分氨基酸的代謝[4]。Lambert等(2002)[5]對仔豬的研究表明，日糧中添加AKG后能顯著增加門脈中Leu、Lys和Pro的水平，有提高門脈中Ile的趨勢。肝臟是機體清除內毒素的主要場所，肝臟也是內毒素引起的全身炎癥反應中受損最嚴重器官之一[6]。因此LPS刺激可能會對仔豬肝臟氨基酸代謝造成影響。

當前國內外尚未見AKG對免疫應激仔豬氨基酸代謝影響的報道。本試驗應用多次LPS刺激建立仔豬免疫應激模型，研究日糧中添加1%AKG對免疫應激仔豬肝臟氨基酸代謝的影響，為AKG的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

脂多糖（LPS）：由Sigma公司提供，大腸桿菌血清型055:B5。α-酮戊二酸(AKG)：含量99.8%，市售醫藥級產品。

1.2 試驗動物分組及免疫應激模型建立

選取健康，來源、體重基本一致的（24±1）日齡斷奶仔豬[杜洛克×長白×大白，(7.25±0.23)kg]24 頭，隨機分為3個處理組，每組設8個重復，每個重復1頭豬。3個處理組分別為：對照組、應激對照組（LPS組）和試驗組（AKG組）。各組基礎日糧一致，空白對照組和應激對照組飼喂基礎日糧+1%淀粉，AKG組飼喂基礎日糧+1%AKG。試驗期為17 d。LPS組和AKG組仔豬分別于第 10、12、14 和 16 d 腹膜注射 80 μg/kg BW 的LPS，空白對照組注射相應劑量的滅菌生理鹽水。在第17 d，所有仔豬用戊巴比妥鈉（50 mg/kg BW）進行麻醉后屠宰，取肝臟組織，于液氮中速凍后，轉入-80℃冰箱中保存待分析。

1.3 試驗日糧組成與營養水平

基礎日糧參照（NRC 1998）10～20 kg豬的營養需要[4]配制(見表1)。AKG組日糧為基礎日糧+1%AKG，對照組和LPS組的日糧為基礎日糧+1%的淀粉。

1.4 測定指標及方法

稱取100 mg的肝組織置于勻漿器中,加入1.5 mol/l高氯酸1 ml，勻漿后分別兩次用3 ml的三蒸水漂洗，將漂洗液轉移至15 ml的離心管中，緩慢加入2 mol/l碳酸鉀 0.5 ml，混勻，然后 3 000×g/min 離心 5 min，取上清液于-80℃保存待測。

表1 基礎日糧組成及營養水平

采用高效液相色譜法測定肝臟組織中的18種游離氨基酸：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、絲氨酸（Ser）、瓜氨酸（Cit）、蘇氨酸（Thr）、?；撬幔═au)、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）、蛋氨酸（Met）、纈氨酸（Val）、苯丙氨酸（Phe）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、鳥氨酸（Orn）、賴氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）。 具體操作見 Wu 等（2008）[7]的文獻。 采用Waters Breeze高效液相色譜系統，包括二元梯度泵和自動進樣器。色譜條件：色譜柱為Waters XTerra MS C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相 A（0.1 mol/l的乙酸鈉，pH 值 7.2），流動相 B（100%甲醇），流速1.1 ml/min；熒光法檢測器，激發和發射波長分別為340和455 nm。

1.5 數據處理

采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析(ONEWAY ANOVA)和Duncan's方法多重比較，結果均以“平均值±標準差”表示。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析（見表2）

由表2 可見，LPS 刺激后，肝臟 Asp、Asn、Ser、Cit、Thr、Tau、Trp、Met、Val、Phe、Ile、Leu、Orn 和 Pro 濃度均未受到顯著性影響(P＞0.05)；LPS組肝臟Lys濃度較對照組有下降的趨勢（P＜0.1），降低了 20.02%；Tyr濃度降低了18.18%，差異顯著（P＜0.05）。AKG組Glu濃度較對照組和LPS組均有上升的趨勢（P＜0.1），分別上升了 20.71%和 15.56%，Ala濃度較 LPS組上升了37.33%（P＜0.1），但與對照組差異不顯著（P＞0.05）。

表2 AKG對免疫應激下仔豬肝臟游離氨基酸含量的影響（nmol/ml）

3 討論

進入肝臟的AKG在丙氨酸轉氨酶作用下與丙氨酸反應生成谷氨酸和丙酮酸，也可在天門冬氨酸轉氨酶的作用下與天冬氨酸反應生成谷氨酸和草酰乙酸。谷氨酸在谷氨酸脫氨酶作用下通過脫氨基產生氨和AKG，而轉氨酶催化下將谷氨酸一個氨基的一部分轉移到α-酮酸，形成AKG和相應的支鏈氨基酸。AKG還可以與肝內的氨結合生成谷氨酸，谷氨酸再與氨結合生成谷氨酰胺，因此AKG可以作為NH4+的清除劑。另外，經α-酮戊二酸進入三羧酸循環的氨基酸有精氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸以及谷氨酸等谷氨酰胺族氨基酸，同樣，α-酮戊二酸也能通過三羧酸循環途徑改變其他氨基酸的代謝，直接或間接發揮其生理功能。谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、瓜氨酸和脯氨酸均為功能性氨基酸，不僅對動物的正常生長和維持是必需的，而且對很多生物活性物質的合成也是必需的（Wu，2007）[8]。本試驗中 AKG 組與 LPS組比較谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、瓜氨酸均有所提高。

動物處于免疫應激時，機體的養分從用于生長轉向優先滿足免疫系統代謝改變的需要。動物應激時基礎代謝提高、骨骼肌蛋白沉積下降、肝急性期蛋白合成上升、抗體生成上升、氨基酸糖異生的量上升[1]，這就意味著免疫應激狀態下動物機體代謝的改變很可能會影響動物的氨基酸需要模式。李建文等（2006）[9]以仔豬[(9.03±0.63)kg BW]為研究對象，在試驗的前1 d、試驗第2、4、6 d給應激組注射200 μg/kg BW脂多糖，正常組注射等劑量的無菌生理鹽水，結果表明與正常條件下的氨基酸模式相比，應激條件下氨基酸模式中Met和Thr略有下降，而Trp有很大程度的增加（正常情況下Trp為21，應激情況下Trp為29），研究還指出：肌肉蛋白質與急性期蛋白質氨基酸組成的差異表明，免疫應激期內對Phe和Trp的需求增加是為了滿足急性期蛋白質合成。高蔚娜等（2008）[10]以大鼠為研究對象，用H2O2誘導大鼠肝細胞發生氧化應激，研究了槲皮素對氧化應激大鼠肝細胞氨基酸代謝的影響，結果顯示氧化應激下大鼠肝臟Met、His和Ala含量顯著減少，Tau含量增加。Met、His和Ala轉氨基后生成的丙酮酸以及應激過程中生成Tau都可作為活性氧的清除劑[11]，Met、Tau、His等氨基酸可能是氧化應激防御機制的組成部分，參與哺乳動物對氧化應激生理-病理反應的調節。Kristensen等（2002）[12]以豬為研究對象，研究表明通過腸道補充AKG能促進體內Pro的合成,增加動脈血中Pro的含量(P＜0.05),并有增加動脈血中Gln的含量的趨勢（P＜0.1），而Pro對于膠原蛋白的合成過程起著重要的作用。同時，通過從腸道添加 AKG能增加門脈中 Leu、Lys和 Pro的濃度 (P＜0.05)，并有提高門脈中 Leu和Ile濃度的趨勢 （P＜0.1）。 Tatara 等（2005）[13]以火雞為研究對象，通過每天在火雞日糧中添加0.4 g/kg BW的AKG，試驗期為97 d，結果表明 AKG組血漿中 Tau、Pro、Leu的濃度顯著高于對照組 （P＜0.05），而Gln濃度顯著低于對照組（P＜0.05）。

本試驗結果顯示，多次LPS刺激后,仔豬肝臟Tyr含量顯著下降(P＜0.05);Lys含量有下降的趨勢(P＜0.1)。其可能原因是免疫應激增加了肝臟對Tyr和Lys的需求以用于滿足急性期蛋白的合成。由本試驗結果還可以看出，AKG組Tyr、Lys的含量與LPS組和對照組差異均不顯著，并且Ala的含量較LPS組有上升的趨勢，而Glu的含量較對照組和LPS組均有上升的趨勢。其可能原因是AKG能通過直接或間接的途徑激活肝臟Glu和Ala的生成途徑，Glu可能用作受損肝臟修復的能量供應燃料，而Ala可能通過轉氨基生成的丙酮酸作為活性氧的清除劑[12]。試驗結果表明LPS刺激影響了肝臟組織中部分游離氨基酸的含量，而AKG可以在一定程度上緩解LPS刺激對肝臟氨基酸代謝的影響。

4 結論

AKG能在一定程度上緩解免疫應激對仔豬氨基酸代謝的影響，減輕LPS刺激對仔豬肝臟損傷。

[1]Feldmann M,Dale D.Cell cooperation in the immune response[J].Immunology，1989(2)：147.

[2]Pierzynowski S G,Sjodin A.Perspectives of glutamine and its derivatives as feed additives for farm animals[J].J.Anim.Feed Sci.,1998，7:79-91.

[3]Blomqvist B I,Hammarqvist F,von der Decken A,et al.Glutamine and alpha ketoglutarate prevent the decrease in muscle free glutamine concentration and influence protein synthesis after total hip replacement[J].Metabolism,1995,44(9):1215-1222.

[4]王天芳，楊維益，梁嶸，等.體康復對運動性疲勞大鼠海馬組織中游離氨基酸的影響[J].北京中醫藥大學學報，1998，21（4）：26-29.

[5]Lambert B D,Stoll B,Niinikoski H,et al.Net portal absorption of enterally fed alpha-ketoglutarate is limited in young pigs[J].J.Nut.,2002,132:3383-3386.

[6]Risuke K,Shigeru M.The molecular pathologenesis of Endotoxic shock and organ failure[J].Molecular Medicine Today,1999(3):123-132.

[7]Wu G Y,Meininger C J.Analysis of citrulline,argninine,and methylarginines using high-performance liquid chromatography[J].Methods in Enzymlology,2008(440):177-189.

[8]Wu G Y,Bazer F W,Davis T A,et al.Important roles for the arginine family of amino acids in swine nutrition and production[J].Livestock Science，2007(112):8-12.

[9]李建文，陳代文，張克英，等.免疫應激對仔豬理想氨基酸平衡模式影響的研究[J].畜牧獸醫學報，2006，37（1）：27-34.

[10]高蔚娜，郭長江，吳健全，等.槲皮素對氧化應激大鼠肝細胞氨基酸代謝的影響[J].氨基酸和生物資源，2008，30(1)：53-56.

[11]Livine R L,Berlett B S,Moskovitz J，et al.Methionine residues may protect proteins from critical oxidative damage[J].Mech Ageing Dev.,1999,107(3):323-332.

[12]Kristensen N B,Jungvid H,Fernandes J A,et al.Absorption and metabolism of alpha-ketoglutarate in growing pigs[J].J.Anim.Physiol Nutr.,2002，86:1-7.

[13]Tatara M R,Brodzki A,Krupski W,et al.Effects of α-ketoglutarate on bone homeostasis and plasma amino acids in turkeys[J].Poultry Sci.,2005,84:1 604-1 609.