蓮草方多糖與黃酮提取工藝條件的優(yōu)化研究

漢麗梅 王洪波 李天來

白花蛇舌草(Hedyotic diffusa)和半枝蓮藥物資源豐富，兩者所含有的多糖、黃酮類化合物等化學(xué)成分具有廣泛的藥理活性，白花蛇舌草的藥理作用包括抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力、抗化學(xué)誘變、抗感染作用等[4]。目前，白花蛇舌草的藥理研究大多集中在免疫活性與抗腫瘤活性兩方面。臨床上主要用于治療各種癌癥、肝炎、腎炎、胃炎、呼吸系統(tǒng)感染、婦科疾患、闌尾炎等[5]。半枝蓮具有抗癌、抗病毒、解熱、保肝、抗焦油致突變、抑菌、抗氧活性及抗衰老作用等[6]。但是目前關(guān)于白花蛇舌草和半枝蓮兩者聯(lián)合應(yīng)用及對(duì)其主要活性成分的研究還很少見報(bào)道。多糖和黃酮類化合物均具有多方面的藥理作用。多糖有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤活性、降血糖、抗氧化和抗衰老等功能；黃酮類化合物能預(yù)防病菌感染、抑制腫瘤、清除自由基等作用，并對(duì)高血壓、高血脂等心血管系統(tǒng)疾病有較好的防治作用[7]。

因此本研究綜合白花蛇舌草和半枝蓮的藥理作用，擬探討其多糖和黃酮等活性成分在動(dòng)物病毒病防治方面的應(yīng)用，對(duì)其提取條件進(jìn)行研究，藥物開發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)蓮草方在畜牧業(yè)方面的開發(fā)應(yīng)用提供一定的參考。為開發(fā)蓮草方在動(dòng)物性食品生產(chǎn)方面的應(yīng)用價(jià)值，本研究以蓮草方（半枝蓮/白花蛇舌草質(zhì)量比為1：2）為原料，對(duì)蓮草方多糖和總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，為進(jìn)一步開發(fā)白花蛇舌草和半枝蓮在動(dòng)物性食品生產(chǎn)過程中的藥用價(jià)值提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白花蛇舌草與半枝蓮，均購于沈陽同仁堂大藥房。主要試劑：D-(+)-Glucose（批號(hào) G8270），購于 Sigma；蘆丁(批號(hào)080529)，購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；石油醚、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純。

1.2 主要儀器

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；WFJ 7200型可見分光光度計(jì)[尤尼柯（上海）儀器有限公司]；80-2臺(tái)式低速離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠）；DHG-9123A型新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（寧波江南儀器廠）；索氏提取器；小型粉碎機(jī)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蓮草方多糖提取方法

熱水提取是多糖提取最常用的方法[1]。將蓮草方用石油醚回流脫脂后，60℃烘干備用。取2 g脫脂試材，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，選定三個(gè)不同水平按照L9（34）進(jìn)行水提正交試驗(yàn)，初步確定多糖提取條件，然后再進(jìn)行單因素試驗(yàn)研究不同提取時(shí)間、提取溫度、液固比和提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響，最后確定多糖提取的最優(yōu)工藝條件。將水提液濃縮到原體積的1/5左右，用6倍體積的乙醇沉淀多糖。

1.3.2 蓮草方總黃酮提取方法

蓮草方脫脂烘干后，準(zhǔn)確稱取4 g置于平底燒瓶中，加入乙醇溶液，90℃恒溫水浴回流提取總黃酮。檢測不同液固比、提取時(shí)間、乙醇濃度和提取次數(shù)對(duì)黃酮提取率的影響，在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定蓮草方總黃酮的最佳提取條件。

1.3.3 多糖和總黃酮含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[2]；采用硝酸鋁顯色法，以蘆丁為標(biāo)樣，在510 nm處測定其吸光值，測定總黃酮[3]。

多糖提取率（%）=（多糖含量/樣品干重）×100%。

總黃酮提取率（mg/g）=總黃酮含量/樣品干重。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮草方多糖的提取

2.1.1 蓮草方多糖提取正交試驗(yàn)

采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行蓮草方多糖提取，初步確定多糖提取條件，提取溫度（A）、液固比（B）和提取時(shí)間（C）三因素和三水平選擇見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。由極差分析可知，各因素對(duì)多糖提取的影響由大到小分別為提取溫度（A）＞提取時(shí)間（C）＞液固比（B）。根據(jù)正交試驗(yàn)初步確定蓮草方多糖提取條件為A3B1C3，即提取溫度為100℃，液固比為20 ml/g，提取時(shí)間為4 h。

表1 多糖提取條件因素水平設(shè)計(jì)

表2 多糖提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 蓮草方多糖提取的單因素試驗(yàn)

2.1.2.1 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響（見圖1）

圖1 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

在提取溫度為100℃、液固比為20 ml/g的條件下，研究提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。結(jié)果表明，隨提取時(shí)間延長，多糖提取率增大，提取時(shí)間達(dá)到4 h以后，多糖提取率增有下降的趨勢(shì)，因此，提取時(shí)間以4 h為宜。

2.1.2.2 液固比對(duì)多糖提取率的影響（見圖2）

在提取時(shí)間為4 h、溫度為100℃的條件下，研究液固比對(duì)多糖提取率的影響。結(jié)果表明，隨提取液用量的增加，多糖提取率增大，當(dāng)液固比達(dá)到30 ml/g以后，多糖提取率開始下降，而加水量增加會(huì)加重后序濃縮負(fù)擔(dān)，加大能源消耗，因此，最佳液固比為20～30 ml/g。

圖2 液固比對(duì)多糖提取率的影響

2.1.2.3 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響（見圖3）

在提取時(shí)間為4 h、液固比為20 ml/g的條件下，隨提取溫度升高，多糖提取率逐漸增大，但水浴加熱最高溫度為100℃，因此100℃時(shí)多糖提取率為最佳。

2.1.2.4 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響（見圖4）

圖3 溫度對(duì)多糖提取率的影響

圖4 不同提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

用上述確定的最優(yōu)工藝條件，即100℃、液固比為20 ml/g、提取時(shí)間4 h條件下，研究提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響。結(jié)果表明，對(duì)蓮草方反復(fù)提取，當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到2次以后，多糖提取率增幅不明顯，兩次提取可將蓮草方多糖基本提取完全，確定提取次數(shù)為2次。

2.1.3 蓮草方多糖提取條件的優(yōu)化結(jié)果

研究結(jié)果表明，蓮草方多糖最佳提取條件為100℃、液固比為20 ml/g、提取時(shí)間為4 h、提取2次。在此條件下，蓮草方多糖提取率為6.89%。

2.2 蓮草方總黃酮的提取

2.2.1 蓮草方總黃酮提取的正交試驗(yàn)（見表3、表4）

表3 總黃酮提取因素水平設(shè)計(jì)

由表4正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，影響黃酮提取效果的因素依次為：乙醇濃度、液固比、提取時(shí)間。初步確定黃酮提取工藝組合為A1B3C3，即：乙醇濃度為60%、液固比為90 ml/g，提取時(shí)間為4 h。

表4 總黃酮提取正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 蓮草方總黃酮提取的單因素試驗(yàn)

2.2.2.1 乙醇濃度對(duì)蓮草方總黃酮提取率的影響（見圖5）

在 90℃，液固比為 90（ml/g）條件下，提取 4 h，考察不同乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響。

由圖5可知，在低乙醇濃度的條件下，隨乙醇濃度的增加，黃酮提取率增大。當(dāng)乙醇濃度為50%，黃酮提取率最大，乙醇濃度繼續(xù)增加，黃酮提取率下降，因此乙醇濃度應(yīng)選50%為宜。

圖5 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響

2.2.2.2 液固比對(duì)蓮草方總黃酮提取率的影響（見圖6）

圖6 液固比對(duì)黃酮提取率的影響

在50%乙醇濃度，提取時(shí)間為4 h條件下，研究不同液固比對(duì)總黃酮提取率的影響。

由圖6可以看出，隨提取液用量增加，黃酮提取率逐漸增加，當(dāng)液固比達(dá)到90 ml/g以后，黃酮提取量反而下降，因此，選擇液固比為90 ml/g比較適宜。

2.2.2.3 提取時(shí)間對(duì)連草方總黃酮提取率的影響（見圖7）

圖7 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

在50%乙醇濃度和液固比為90 ml/g的條件下，考察不同提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響。

由圖7可以看出，隨提取時(shí)間的延長，黃酮提取率增加，但據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，溫度過高，易使黃酮被破壞，雜質(zhì)溶出量增加，因此本試驗(yàn)條件下選擇提取時(shí)間為4 h較為合適。

2.2.2.4 提取次數(shù)對(duì)蓮草方總黃酮提取率的影響（見圖8）

圖8 提取次數(shù)對(duì)黃酮提取率的影響

在上述確定的最優(yōu)工藝條件，即50%乙醇、液固比90 ml/g、90℃水浴中提取4 h條件下，對(duì)蓮草方反復(fù)提取，進(jìn)一步考察提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響。

由圖8可以看出，第二次和第三次提取出的黃酮含量很少，一次提取可將大部分黃酮提取出來。所以，確定提取次數(shù)為1次。

研究結(jié)果表明，蓮草方總黃酮最佳提取條件為50%乙醇、液固比為90 ml/g、提取時(shí)間為4 h、提取1次。在此條件下，蓮草方總黃酮提取率為6.46 mg/g。

3 小結(jié)與討論

3.1 采用熱水提取、乙醇沉淀多糖的方法，通過單因素和正交試驗(yàn)，確定提取連草方多糖的最佳工藝條件為：提取溫度100℃、液固比20 ml/g、提取時(shí)間4 h、提取2次，在此條件下，多糖提取率為6.89%。

3.2 以乙醇為溶劑，通過單因素和正交試驗(yàn)，得出了蓮草方總黃酮的優(yōu)化提取工藝條件，即以50%乙醇為溶劑，液固比為90 ml/g，在90℃水浴加熱回流提取4 h，提取1次，總黃酮提取率為6.46 mg/g。

3.3 本研究工藝簡單，多糖和總黃酮提取率高，但對(duì)粗提物的分離純化以及生物活性，還有待于進(jìn)一步研究。

3.4 蓮草方多糖是一種復(fù)合多糖，直接以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，測定得到的總多糖與實(shí)際樣品中多糖含量有差別，嚴(yán)格講還應(yīng)該與蓮草方純多糖進(jìn)行比較，再通過換算因子進(jìn)行換算，通常不經(jīng)過換算的結(jié)果比換算后的結(jié)果偏小。但由于純多糖不易得到，本文是以葡萄糖計(jì)的多糖含量，最終結(jié)果對(duì)蓮草方的開發(fā)應(yīng)用具有一定的參考價(jià)值。

3.5 研究提取工藝時(shí)采用先進(jìn)行正交試驗(yàn)后進(jìn)行單因素試驗(yàn)的方法，初步確定多糖和黃酮的提取條件，減少了在確定條件時(shí)影響因素過多、因素水平過多造成的過多的重復(fù)操作，節(jié)約了資源，同樣可以獲得相應(yīng)的結(jié)果。

[1]王濤，趙謀明.多糖的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代食品科技，2007，23（1）：103-106，95.

[2]馮穎.無梗五加果多糖與黃酮化合物的提取純化及生物活性研究[D].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2006，6.

[3]陳敏敏.三味傳統(tǒng)中藥的抗腫瘤活性及有效成分研究[D].廣東工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2005，5.