混菌固態發酵啤酒糟生產蛋白飼料的研究

王 穎 馬海樂

隨著啤酒工業迅速發展，啤酒糟作為啤酒生產的主要副產物其產生量也在增加。啤酒糟中固形物含量一般為15%～25%，水分含量高，極易腐敗變質，但干糟中含粗蛋白35%～51%，加以開發也是一種很好的飼料蛋白來源。目前國內多數啤酒生產企業將啤酒糟直接出售用作飼料，這種飼料中的非蛋白氮和無機氮不能被飼養動物有效利用，纖維素也阻礙了營養成分的吸收，由于含水量較高，很難貯藏，一旦滯銷很容易霉爛、腐敗而影響環境。利用固態發酵生物轉化啤酒糟可以將其成分改性，很多研究表明利用發酵方法可以有效提高啤酒糟蛋白質含量。

在混菌發酵啤酒糟的過程中，微生物和發酵基質內發生著復雜的物理、化學和生物以及物質和能量的傳遞。在周圍復雜的外界條件中，影響啤酒糟固態發酵生產優質蛋白飼料的因素較多。本研究以啤酒糟為主要原料，以培養一段時間的枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母菌的豆粕培養液為菌種，以接種量、發酵時間、尿素添加量以及硫酸銨添加量等為因素建立正交試驗進行優選，生產出蛋白氮含量高的活性飼料。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：啤酒濕糟，鎮江天目湖啤酒有限公司提供，干糟中真蛋白含量約為21%；豆粕，用錘片式粉碎機粉碎，過60目篩，丹陽市正大油脂有限公司提供。

菌種：枯草芽孢桿菌M5094、熱帶假絲酵母C3161，由常州新區三環生物工程成套設備有限公司提供。

主要培養基：斜面培養基為麥芽汁培養基(培養酵母用)和LB培養基(培養枯草芽孢桿菌用)；液體種子培養基為YPD培養基 (培養酵母用)和LB培養基(培養枯草芽孢桿菌用)。

1.2 發酵處理方法

混菌豆粕培養液制備：挑取枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母菌各一環接入相應的液體培養基，搖床培養1 d后接入滅菌的豆粕培養液中，豆粕培養液成分為豆粕15 g，葡萄糖添加量1 g，自來水85 ml，pH值4.5。

啤酒糟發酵：將生長3 d的混菌豆粕培養液接入啤酒糟培養基?？疾旎A培養基成分、接種量、硫酸銨添加量和尿素添加量對發酵產品真蛋白的影響。

1.3 發酵產品真蛋白測定方法

發酵產物在60℃下烘干后粉碎，準確稱取試樣1～2 g置于250 ml燒杯中，加蒸餾水50 ml煮沸30 min。依次加入10%硫酸銅水溶液20 ml和2.5%氫氧化鈉溶液20 ml，邊加邊攪拌，加完后繼續攪拌幾分鐘。放置2 h或靜置過夜，沉淀物以中速定量濾紙過濾。用70℃以上熱水反復洗滌沉淀，直至濾液無沉淀為止(取氯化鋇試液滴于表面皿中，加2 mol/l鹽酸溶液1滴，滴入濾液，在黑色背景下觀察應無白色沉淀)。然后，將濾紙和沉淀物包好，放人烘箱中在65～70℃下干燥2 h。

將濾紙與沉淀物一起放入凱式燒瓶中，消化后用凱式定氮法測定樣品中真蛋白含量，同時做空白對照(對應加入一塊濾紙消化)。

2 結果與討論

2.1 啤酒糟與豆粕配比的選擇

試驗用啤酒糟含水量為75%，含水量較多，而豆粕粉含水量為9%，在啤酒糟中添加適宜的豆粕粉，可以吸收濕糟多余的水分，同時提高發酵物營養成分。試驗選擇啤酒糟與豆粕粉配比分別為：9：1、8：2、7： 3、6： 4。其中 9： 1、8： 2 配比時豆粕不能完全吸收酒糟的水分，混合物底層有滲下來的水分；而6：4配比時豆粕添加量稍多，混合物底層有未吸附水分的豆粕；7：3配比最適，豆粕粉可與啤酒糟均勻混合。本試驗選擇啤酒糟與豆粕配比為7：3。

2.2 發酵時間對發酵產物真蛋白含量的影響（見圖1）

試驗設置為：基質培養基成分為啤酒糟70%、豆粕粉 30%；發酵時間選擇 1、2、3、4、5、6 d；接種量20%；50 g基質培養基放入250 ml的藍蓋瓶內，置于28℃培養。

圖1 發酵時間對真蛋白含量的影響

由圖1可見，在發酵初期，隨著發酵時間的延長，產品中真蛋白含量先增加，之后逐步降低，當發酵時間為2 d時，產品中真蛋白含量最高。故此時應停止發酵，如繼續發酵產品中粗蛋白含量會因微生物的自溶而下降。在工業化生產中，發酵周期過長，還可能造成雜菌污染，影響發酵產品的品質，增加生產成本，故發酵時間以2 d左右為宜。

2.3 接種量對發酵產物真蛋白含量的影響（見圖2）

試驗設置為：發酵時間為2 d；接種量選擇10%、20%、30%、40%、50%；基礎培養基和培養方法同上。

圖2 接種量對產品真蛋白含量的影響

由圖2可見，隨著接種量的增加，發酵產品中真蛋白含量先增高再下降，當接種量為20%時，發酵產品中真蛋白含量最高，當繼續增加接種量時，真蛋白含量反而下降，這主要是由于接種量過大，雖使發酵周期縮短，菌體生長速度加快，但菌絲易老化，且發酵中的營養物質更多的消耗在菌體生長上，故產品中真蛋白的含量呈現下降趨勢。

2.4 硫酸銨添加量對發酵產物真蛋白含量的影響（見圖3）

試驗設置為：接種量20%；硫酸銨添加量選擇0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%；發酵時間、基礎培養基和培養方法同上。由圖3可以看出，添加硫酸銨混菌發酵產物的真蛋白質含量明顯提高，但當添加量達到0.5%以后，繼續添加硫酸銨，產物真蛋白質含量不再增加。所以選擇0.5%為最佳硫酸銨添加量。

圖3 不同濃度的硫酸銨對發酵產物蛋白質含量的影響

2.5 尿素添加量對發酵產物真蛋白含量的影響（見圖4）

試驗設置為：硫酸銨添加量為0.5%；尿素添加量選擇 0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%；接種量、發酵時間、基礎培養基和培養方法同上。

圖4 不同濃度的尿素對發酵產物蛋白質含量的影響

由圖4可以看出，尿素對發酵產物蛋白含量的作用規律與硫酸銨相似。添加尿素混菌發酵產物的蛋白含量明顯提高，隨著尿素添加量的增加，發酵產物的真蛋白含量相應增高，但當添加量增加到1%以后，繼續添加尿素，產物真蛋白含量不再增加。而且，氮源添加量濃度過高，產品有較刺鼻的氨味，產品風味變差。

由圖3和圖4可見，混菌固態發酵過程中對于超過1.0%高濃度的非蛋白氮源利用率較小，而且在發酵過程中對硫酸銨和尿素的利用能力都較好，此結果與張福元研究結論一致。

2.6 正交試驗

根據單因素試驗結果，以發酵時間、接種量、硫酸銨添加量和尿素添加量為試驗因子，進行四因素三水平的正交優化試驗。以酒糟發酵過程中產品真蛋白含量為考察指標。試驗安排、試驗結果及試驗分析如表1、2、3 所示。

表1 正交試驗L9(34)影響因素及水平

由表2可知，極差分析所得最優展望組合為A1B2C1D2，按照極差大小，影響啤酒糟發酵過程中產品真蛋白含量的4個因素的主次順序依次為A>B>D>C，即培養天數、接種量、硫酸銨添加量、尿素添加量。經方差分析(見表3)可知，發酵時間對啤酒糟發酵過程中產品真蛋白含量有顯著性影響。

表2 L9(34)正交試驗直觀分析

表3 正交試驗方差分析

因最優展望組合A1B2C1D2未在正交表中，所以對該展望組合進行驗證試驗。采用3個批次，每批3個平行樣，測量結果真蛋白平均值為39.13%，高于正交表中的最大值38.49%，由此，確定組合A1B2C1D2為本試驗最優反應條件，即最佳發酵條件為啤酒糟與豆粕粉混合比例為7：3，硫酸銨添加量為0.5%，尿素添加量為0.5%，混菌豆粕培養液接入量為20%，發酵時間為1 d。

3 結論

(1)通過啤酒糟和豆粕粉的合理配比，可以利用豆粕吸附酒糟中過多的水分，達到適宜的固態發酵含水量，可節省工業步驟，簡化操作過程。

(2)混菌發酵啤酒糟可明顯提高啤酒糟中的蛋白含量，提高啤酒糟的營養。真蛋白可提高到39.13%。

(3)發酵天數是發酵的主要因素，經過優化試驗，測得最優工藝條件為：啤酒糟與豆粕粉混合比例為7：3，硫酸銨添加量為0.5%，尿素添加量為0.5%，混菌豆粕培養液接入量為20%，發酵時間為1 d。

若干篇，刊略，需者可函索）