飼料中添加包膜丁酸減少沙門氏桿菌在家禽腸道中定植和排泄規律的研究

萬曉莉 （譯） 楊在賓 （校）

（摘自:Poultry Science，2005（84）：1851-1856；原文作者：Van Immerseel,F 等）

歐洲一項新法規規定，所有成員國必須執行對家禽沙門氏桿菌的監控 (EuropeanParliament等,2003a、b)。注射疫苗可以減少產蛋期母雞體內的細菌定植和蛋的污染(Davies等,2003a;Van Immerseel等，2005)。由于肉仔雞飼養期短，不推薦使用疫苗 (Van Immerseel等，2005)。生產中常使用母源抗體和抗菌飼料添加劑，并結合衛生檢測等聯合手段防控肉仔雞沙門氏桿菌的感染 (Methner等，1997；Van Immerseel等2002；Davies等，2003b)。

短鏈脂肪酸具有殺菌作用，生產中已經廣泛應用于肉仔雞沙門氏桿菌的控制。市場上常用的短鏈脂肪酸有兩種制劑類型：無膜制劑和包膜酸制劑。無膜制劑即粉末或液體產品，主要添加到飼料或飲水中以殺滅其中的沙門氏桿菌，由于無膜制劑快速吸收，其作用僅限于嗉囊(Thompson等,1997)。所有對沙門氏桿菌有抗菌作用的酸都可以制成包膜制劑 (Al-Chalaby等，1985；Hume 等，1993；Moore 等，2004)。包膜或膠囊制劑需要用礦物質或脂類做載體，將短鏈脂肪酸進行包膜或膠囊處理，把酸帶到雞的腸道，使腸上皮細胞與酸直接接觸，同時這些酸可以改變腸內微生物區系的組成，而且有利于在沙門氏桿菌誘發上皮細胞發病的關鍵部位，使酸與沙門氏桿菌密切接觸。因此，應該科學選擇包膜處理的復合酸制劑，以發揮短鏈脂肪酸的殺菌或者更復雜的作用。有研究表明，包膜丁酸控制沙門氏桿菌定植的作用強于包膜甲酸，更優于包膜乙酸(Van Immerseel等，2004a)。丁酸能抑制致病基因的表達和體外沙門氏桿菌對上皮細胞的入侵，乙酸則不能(Lawhon 等，2002；Van Immerseel等，2004b)。據了解，有關丁酸對雞沙門氏菌菌群作用的報道只有一項，是對無特定病原體（SPF）產蛋型雛雞的研究(Van Immerseel等，2004a)，對肉仔雞的研究還未見報道。

該研究通過兩個實驗即實驗一，比較了粉末和包膜丁酸制劑控制無特定病原體（SPF）雞早期口腔接種腸炎沙門氏桿菌在體內定植的作用；實驗二評估了包膜丁酸對從感染腸炎沙門氏桿菌到屠宰年齡的肉仔雞沙門氏桿菌定植的作用效果。

1 材料和方法

1.1 沙門氏桿菌

本研究所用76Sa88品系4型腸炎沙門氏桿菌，是從養禽場中分離的一個典型品系 (Desmidt等，1997、1998)，在溶菌肉湯（LB）培養基中培養6 h，隨后在亮綠瓊脂培養基（BGA;Oxoid,Basingstoke,England）中培養稀釋10倍的細菌懸浮液，計算每毫升菌落形成單位數量，然后用磷酸鹽緩沖液稀釋到接種所需濃度。

1.2 實驗雞

實驗一：無特定病原體羅曼白雞 (Iffa-Credo,Brussels,Belgium)孵化雛雞，隔離舍飼。每次實驗開始前，處死20只處于孵化期的雞，用抗腸炎沙門氏桿菌酶聯免疫吸附分析法（ELISA）(Desmidt等，1996)檢測其血清樣品中的腸炎沙門氏桿菌母源抗體，檢測結果均顯陰性。雞只自由飲用高壓滅菌水，自由采食照射飼料(采用 25 kGy of γ-irradiation 照射)，飼料中補充1.3節飼料添加劑。

實驗二：選擇當地同一孵化場的接種疫苗的1日齡相同親本的羅斯肉仔雞。未檢測母源抗體，隨機分為兩組，每組50只。試驗雞自由飲水，飼喂小麥基礎日糧。

1.3 飼料添加劑

兩種丁酸制劑：第一種是粉末丁酸鹽，含98%n-丁酸鈉鹽的白色或米黃色粉末；第二種是包膜丁酸鈉鹽：含30%正丁酸鈉鹽的微膠囊。

1.4 實驗步驟

實驗一：無特定病原體羅曼白雞隨機分4個處理，每個處理25只，在孵化當天檢測泄殖腔拭子沙門氏桿菌。從孵化當天（雛雞1日齡），第1、2、3個處理組的日糧中分別添加0.63 g/kg粉末丁酸制劑、2.5 g/kg包膜丁酸制劑和復合丁酸制劑（0.315 g/kg粉末丁酸+1.25 g/kg包膜丁酸），3個處理組有效丁酸 (或鈉鹽)數量相同。第4個處理組為對照（不添加丁酸制劑）。第5 d，所有 SPF蛋雞用塑料管口腔接種 106CFU 76Sa88腸炎沙門氏桿菌。第6 d，取泄殖腔拭子檢測沙門氏桿菌。第8 d，處死所有雞，從盲腸、肝臟和脾臟取樣進行細菌學檢驗。

實驗二：選擇1日齡羅斯肉仔雞100只，隨機分2個處理，每個處理50只。檢測所有雞的泄殖腔拭子沙門氏桿菌。從孵化當天開始，處理1組飼喂以小麥為主的幼雛開口日糧，10 d后換成肉仔雞日糧。處理2飼料中添加2.5 g/kg包膜丁酸。孵化后第5 d，每個處理10只肉仔雞口腔接種105CFU 76Sa88腸炎沙門氏桿菌。在第 6、9、13、20、27、34 和 41 日齡，對所有雞的泄殖腔拭子進行細菌學檢驗。第42日齡，靜脈注射T61處死所有肉仔雞，從盲腸采樣進行細菌學檢驗。

1.5 細菌學檢驗

泄殖腔拭子在亮綠瓊脂培養基上直接接種細菌，37℃培養過夜。直接接種后呈陰性，在緩沖蛋白胨水培養基(Oxoid)中，37℃過夜培養預增菌，然后取1 ml加入9 ml亮綠肉湯培養基中(Oxoid)。培養過夜后，取1滴懸浮液，用亮綠瓊脂培養基繼續培養。計算沙門氏桿菌陽性雞所占比例，用SPSS 10.0軟件進行二元回歸分析統計，分析沙門氏桿菌陽性雞所占比例在不同時間點的差異。

從盲腸、肝臟和脾臟采樣，使其均質化，分別用5、10、20倍緩沖蛋白胨水培養基稀釋液稀釋10倍。取每種稀釋液6×12 μl接種到亮綠瓊脂培養基上。過夜培養（37℃）后，對形成的菌落計數，以計算每克組織的菌落形成單位。對滴定后呈陰性的樣品預增殖或增殖，如前所述。用SPSS10.0軟件統計分析4個不同處理攜帶一定范圍細菌數的雞只數量的差異，如表1～表3所示。非參數秩合檢驗（秩和檢驗是非參數檢驗中檢驗效率比較高，而且又是最常用的一種方法）檢測固定誤差，非參數曼-惠特尼檢驗（曼-惠特尼檢驗又稱“曼-惠特尼秩和檢驗”，是由H.B.Mann等于1947年提出的。它假設兩個樣本分別來自除了總體均值以外完全相同的兩個總體，目的是檢驗這兩個總體的均值是否有顯著的差別。）檢測組間的顯著差異(Maxwell等,1990)。

2 結果與討論

2.1 粉末和包膜丁酸制劑控制SPF雞早期口腔接種腸炎沙門氏桿菌在體內定植的比較

泄殖腔拭子接種腸炎沙門氏桿菌之前雛雞呈陰性，感染后1 d的泄殖腔拭子檢測，沙門氏桿菌定植陽性的雞只數量為：對照組10只，添加粉末丁酸組8只，包膜丁酸組4只，復合丁酸組3只（即實驗一第6 d，取泄殖腔拭子檢測沙門氏桿菌得到的結果）。

表1 無特定病原體蛋雞5日齡口腔接種106CFU 76Sa88腸炎沙門氏桿菌，8日齡時盲腸中腸炎沙門氏菌定植檢測①

表2 無特定病原體蛋雞5日齡口腔接種106CFU 76Sa88腸炎沙門氏桿菌，8日齡時肝臟中腸炎沙門氏菌定植檢測①

表3 無特定病原體蛋雞5日齡口腔接種106CFU 76Sa88腸炎沙門氏桿菌，8日齡時脾臟中腸炎沙門氏菌定植檢測①

每克盲腸菌落形成單位的數目明顯不同，如表1所示。添加包膜丁酸或復合丁酸，盲腸中大于106CFU/g菌落明顯低于其他兩組（P＜0.05）。肝臟中菌落在所有處理中都較少（見表2），統計分析表明，飼料中添加復合丁酸，可使肝臟中大于103CFU/g菌落明顯少于其他處理（P＜0.05）。同時，添加復合丁酸，脾臟中大于104CFU/g菌落明顯低于（P＜0.05）對照組和添加粉末丁酸鹽處理組（見表3）。上述統計分析表明，不同處理在不同器官表現出菌落的雞只數分布不同。

2.2 飼料中添加包膜丁酸減少沙門氏桿菌在家禽腸道中定植和排泄的規律

對泄殖腔拭子檢驗呈陰性的雞只，接種腸炎沙門氏桿菌后1周和3周（12和27日齡），對照組泄殖腔拭子直接培養后呈陽性的肉仔雞所占比例分別增加到了35%和40%，而屠宰年齡時只有4.8%的雞直接培養呈陽性。添加丁酸的試驗組，接種腸炎沙門氏桿菌后1周和3周，直接培養后泄殖腔拭子檢驗呈陽性的雞只為15%，到屠宰年齡時下降到2.2%（見圖1）。顯著性檢驗表明，第9日齡（P＜0.01）、第12和27日齡（P＜0.05），兩個處理間差異顯著。

圖1 在亮綠瓊脂培養基（圖1A）和預增殖后（圖1B）直接接種，泄殖腔拭子呈沙門氏桿菌陽性的雞所占比例隨時間（日齡）的變化規律

對所有泄殖腔拭子呈沙門氏桿菌陽性的雞只數目（包括正常飼養條件下陽性者）的分析表明，在20日齡（種雞接種后15 d）時，對照組沙門氏桿菌陽性的雞只數增加到97%，到屠宰年齡時下降到36%。而添加丁酸組，20日齡和屠宰年齡時陽性的雞只數分別為48%和6%。自9日齡（接種后4 d）開始，兩處理組陽性的雞只數差異顯著（P＜0.05）。

細菌學檢驗表明兩組都有68%的肉仔雞在正常飼養條件下（沒有直接培養）呈沙門氏桿菌陽性。

2.3 討論

經研究表明，無特定病原體蛋雞感染腸炎沙門氏桿菌早期，包膜丁酸減少盲腸和內臟菌落的作用強于粉狀丁酸。復合丁酸減少肝臟和脾臟菌落功效最好，其機理有待于進一步研究。由于非包膜丁酸被雞采食后從前消化道吸收，因此其作用僅限于嗉囊，包膜丁酸則可以進入胃腸道后再釋放出丁酸(Thompson等,1997)。如果沒有無膜丁酸的殺菌作用，經過嗉囊后仍存活的腸炎沙門氏桿菌到達腸道后，可能會形成菌落。而包膜丁酸則能夠影響腸道腸炎沙門氏桿菌菌落形成的部位。丁酸可以抑制致病基因的表達，降低腸炎沙門氏桿菌的侵襲力，從而減少盲腸細菌定植 (Porter等，1997；Lawhon等，2002；Van Immerseel等，2004b)。丁酸對腸道微生物區系組成的影響目前尚不明確。

飼料中添加丁酸可以明顯減少感染腸炎沙門氏桿菌的肉仔雞糞便中的菌落。實際上，直接培養和預增殖，菌落數目有很大不同。兩組菌落定植都隨時間減少。只有很少肉仔雞到屠宰年齡時有沙門氏桿菌定植。實驗中，無特定病原體蛋雛雞飼料中添加包膜丁酸，可以減少感染早期盲腸菌落。盡管如此，到屠宰年齡時對照組和添加丁酸組菌落仍相同。因為感染早期補充丁酸組菌落定植少于對照組，盲腸菌落減少，可能會減少糞便中的排出；而且可以假設，肉仔雞感染早期盲腸菌落也會減少。在正常飼養條件下到達屠宰年齡，兩組肉仔雞雖然沒有高度定植，但是，肉仔雞大多都表現沙門氏桿菌陽性。機體內少量沙門氏桿菌是危害公眾健康的主要因素之一，因為糞樣檢測陰性的雞在應激條件下細菌可能會大量定植。而且，從我們的研究和很多其他研究均發現，完全消除雞的沙門氏菌非常困難(Berthelot-Herault等，2003；Beal等，2004；Van Immerseel等，2004c)。

3 結論

丁酸可以減少糞便中沙門氏桿菌的排出，進而減少沙門氏桿菌對環境的污染。然而，只有實施衛生檢測和各種防控措施相結合，才有可能實現沙門氏桿菌的完全消除。

21篇，刊略，需者可函索）