飼料中阿美拉霉素的含量檢測研究

李 政 李 燕 陶興無 余鳳云

阿美拉霉素又稱卑霉素、肥拉霉素。它是由綠色產色鏈霉菌 Tü57（Streptomyces viridochromogenes Tü57）發酵產生的正糖霉素族(orthosomycin)寡糖類多組分的抗生素[1]。難溶于水、吡啶、乙酸，易溶于丙酮、二氯甲烷等有機溶劑。其主要應用于畜牧業，作為飼料添加劑使用，能顯著提高豬、肉雞等動物的平均日增重和飼料報酬，市場應用前景廣闊。目前國內研究多處于菌種選育階段，未進行大規模生產。

在菌種選育過程中，好的篩選方法至關重要，而菌種發酵液抗生素產量的測定更是重中之重。目前國內所報道的阿美拉霉素的含量檢測方法主要有高效液相法[2]和生物監測法[3-4]，但高效液相法成本較高，應用于菌種大規模篩選時很不劃算，而生物監測法周期長，操作繁瑣，受溫度、濕度及操作人員等因素的影響，往往出現較大的誤差。本實驗室根據阿美拉霉素在212 nm處有較大吸收的特點，建立了以薄層-紫外分光光度計檢測阿美拉霉素含量的方法，該法較為簡單、快捷、準確，成本低，尤其適合于阿美拉霉素菌種的大量篩選及無高效液相條件下阿美拉霉素相關產品的含量檢測。

1 實驗儀器及試劑

uv-vis 8500型紫外分光光度計、eppendorf centrifuge 5417R臺式高速冷凍離心機、254紫外分析儀、對照品(美國禮來公司提供)。

微量移液器、HF254硅膠板、展層缸、甲醇、二氯甲烷。

2 實驗步驟及結果

2.1 對照品溶液的配置

精密稱取干燥恒重的阿美拉霉素對照品50mg置于50 ml的容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋到刻度，制成1mg/ml的對照品溶液，儲存備用。

2.2 供試品溶液的制備

阿美拉霉素是一種親脂性寡糖類物質，在水中的溶解度極低，在發酵液中絕大部分存在于菌體的細胞周質空間。因此本實驗室將發酵液離心后直接去上清液，60℃條件下將菌體干燥至恒重。取菌體粉末5 g置于50 ml的離心管中，加入10 ml二氯甲烷振搖提取30 min，離心取上清液儲存備用。

2.3 阿美拉霉素波長的選擇

精密吸取阿美拉霉素對照品溶液1 ml，以甲醇為稀釋液稀釋到20 μg/ml，以甲醇為空白對照，在uvvis 8500型紫外分光光度計上掃描吸收光譜圖，掃描范圍為180.0～400.0 nm，得知阿美拉霉素在212.0 nm和289.0 nm處有吸收峰，212.0 nm處吸收峰最大，則選擇212.0 nm為測定波長，見圖1。

2.4 標準曲線的繪制

以1mg/ml的阿美拉霉素對照品溶液為母液，精確配置濃度為 10、20、30、40、50、60 μg/ml的對照品梯度溶液。以甲醇為空白溶液，置于紫外分光光度計下，在212.0 nm處檢測吸光度，以濃度（x）為橫坐標，以吸光度（y）為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明，阿美拉霉素在 10～60 μg/ml范圍內線性關系良好，見圖2。

圖1 阿美拉霉素對照品波譜掃描圖

圖2 阿美拉霉素對照品曲線

2.5 阿美拉霉素提取液樣品的薄層層析及含量測定

吸取阿美拉霉素供試品與對照品各20 μl，同時在一塊HF254硅膠板上點樣，以二氯甲烷：甲醇（9：1）為展開劑展開，Rf值約為0.4。將硅膠板吹干后，在254紫外分析儀下觀察并畫出有效斑點范圍。用鋼匙刮取上述斑點于容量瓶中，加4 ml的甲醇超聲洗脫15 min，過濾，濾液于10 ml的容量瓶中，用甲醇定容。用標準曲線法測定吸光度并計算含量。

2.6 重復性實驗

精密吸取供試品溶液20 μl點樣于薄層板上，按2.5的方法于212.0 nm波長條件下連續測定5次吸光度，計算RSD值得0.74%，結果表明本方法重復性良好。實驗結果見表1。

2.7 穩定性實驗

精密吸取供試品溶液20 μl點樣于薄層板上，按2.5 節的方法于 212 nm 波長條件下于 0、1、2、3、4、5、6 h測定吸光度，計算RSD值得0.85%。說明樣品在6 h內吸光度穩定。實驗結果見表2。

表1 重復性實驗結果

表2 穩定性實驗結果

2.8 加樣回收率實驗

在同一塊硅膠板下端點樣，第1個點點上已知阿美拉霉素含量的發酵液供試品20 μl，然后在第2個點點上已知濃度的對照液20 μl，第3、4、5個點先點上20 μl的已知阿美拉霉素含量的發酵液樣品，再分別點上10、15、20 μl已知濃度的對照品，展層后按樣品測定法測定各樣品的吸光度，重復測3次，然后換算成含量，計算回收率。回收率=混合液的含量/(混合液含量+已知發酵液樣品含量)。結果表明本方法回收率良好。實驗結果見表3。

表3 加樣回收實驗結果

3 結果與討論

本文首次提出用薄層-紫外分光光度法檢測阿美拉霉素含量的方法適合于在實驗室無高效液相條件下對阿美拉霉素發酵液及其樣品的含量分析檢測。鑒于目前國內阿美拉霉素菌種的產量還不高，大多數實驗室還停留在高產菌株的篩選階段，通過高效液相方法大規模的檢測各個菌種的發酵產量，成本高，設備復雜，檢測耗時長。本方法可以簡便、快捷，相對準確地測定菌種發酵產量，且重復性、穩定性、回收率良好，尤其適合應用于阿美拉霉素高產菌的大規模篩選。

本方法容易受薄層厚度、均勻程度、點樣量的準確性等因素影響，因此操作過程中要嚴格控制條件，方可保證較高的精確度。

[1]Weitnauer G,Mühlenweg A,Trefzer A,et al.Biosynthesis of the orthosomycin antibiotic avilamycin Adeductions from the molecular analysis of the avi biosynthetic gene cluster of Streptomyces viridochromogenes Tü57 and production of new antibiotics[J].Chem.Biol.,2001，8(6):569-581.

[2]張秀英.阿維拉霉素預混劑的含量測定[J].中國獸藥雜志,2000,35(3):21-23.

[3]靳亮,童應凱,王澤立,等.卑霉素高產菌株的選育[J].中國抗生素雜志,2006,5(31):303-305.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典二部 [M].2005年版.附錄Ⅺ.