一種新型轉基因斑馬魚毒物檢測系統的建立

斑馬魚(Brachydaniorerio)，遺傳背景清楚、繁殖周期短、產卵過程可人為控制、懷卵量大、體外受精、胚胎透明便于觀察，因此被廣泛應用于胚胎學、發育生物學、毒理學、分子生物學等研究，是理想的分子生物學和免疫學研究的脊椎動物模型，也是四大模式生物之一[1]。

斑馬魚的轉基因研究始于1988年，此后進展迅速。目前轉基因技術已成熟，因而斑馬魚成為魚類基因工程中基因同源重組、基因表達調控和基因功能研究的理想材料，斑馬魚卵母細胞體外成熟、配子發生和受精的調控機制、胚胎干細胞的分離、基因克隆及基因敲除等都已成為研究熱點[2，3]。據報道，有3種方法利用轉基因斑馬魚檢測環境有害化學物：一種是利用攜帶了整合高拷貝數量的大腸桿菌穿梭載體的斑馬魚來測試環境誘變劑[4]；第二種方法利用標記轉基因斑馬魚，其熒光或熒光素酶受到某種啟動調控元件的誘導，而這種啟動調控元件又受到不同的環境污染物如芳烴、重金屬或環境雌激素的影響[5]；第三種是利用組織限制的熒光標記魚來篩選對其特定發育途徑產生特別作用的環境毒素。

綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP) 是20 世紀90 年代中期發展起來的一種全新的報告分子，它不需要任何外源性底物和輔助因子,無毒、穩定、無污染，可以在UV或藍光激發下直接觀察，而且能在多種異源細胞內表達,被譽為“活細胞探針”。GFP作為報告基因,在轉基因動物研究中應用廣泛。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 質粒和菌株

芳香烴反應元件AHRDtk和pFRMwg+plasmid 載體,自行收藏。DH5α感受態細胞，博大泰克。

1.1.2 斑馬魚

野生型斑馬魚購自青島水族商店，在實驗室于28℃ 淡水中培養，調節12 h明/12 h暗的光照周期，使之產卵，收集受精卵，培養于胚胎培養液或者驅除氯氣的無菌自來水中，根據Kimmel 等的斑馬魚發育時期進行分期。

1.1.3 主要試劑

胚胎培養溶液、胚胎固定液，自制。

限制性內切酶、T4 DNA連接酶、PCR相關試劑等，Takara；RNase A，Merck。

1.1.4 PCR引物與測序

PCR引物與測序均由上海生工完成。

1.2 方法

1.2.1 目的片段擴增

在PCR引物末端設計好酶切位點，上游引物中引入AflⅡ內切酶位點，下游引物中引入SacⅠ位點，以AHRDtk片段為模板擴增目的片斷。

1.2.2 重組載體構建

用AflⅡ和SacⅠ雙酶切pFRMwg+plasmid 載體，膠回收并純化500 bp大小片段。將AHRDtk目的片段克隆至pFRMwg+plasmid 載體，構建重組載體。將其轉化至DH5α感受態細胞，涂板培養過夜后挑出陽性克隆。

1.2.3 陽性克隆的鑒定

分別用AflⅡ和SacⅠ雙酶切、PCR和DNA序列測定的方法對陽性重組子進行鑒定。

1.2.4 顯微注射

將篩選鑒定出的陽性重組子顯微注射至斑馬魚受精卵，經過胚胎繁殖并篩選可穩定遺傳的斑馬魚。

2 結果與討論

2.1 AHRDtk目的片段的擴增

膠回收AHRDtk目的片斷，電泳鑒定結果見圖1。DNA Marker DL2000分別由片段(從大到小)2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp和100 bp組成。

由圖1可知，擴增出約425 bp的目的片段，在1、2兩種退火溫度(分別為60℃和64℃)下，擴增效率明顯不同，因此選擇退火溫度2(64℃)作為最佳實驗條件。

2.2 pFRMwg+plasmid 載體雙酶切

用AflⅡ和SacⅠ雙酶切pFRMwg+plasmid 載體，得到500 bp大小的片段，膠回收純化大片段。pFRMwg+plasmid載體酶切電泳鑒定結果見圖2。

M.DL2000 1.60℃的擴增 2.64℃下的擴增 3.陰性對照

M.DL2000 1.雙酶切片段

2.3 篩選重組子

用T4 DNA連接酶連接純化的AHRDtk目的片段和pFRMwg+plasmid 載體雙酶切的產物，然后用AflⅡ和SacⅠ兩種限制性內切酶雙酶切來鑒定重組子，鑒定結果見圖3。

M.DL2000 1～8.重組子

由圖3可知，5#、7#為陽性重組子。

2.4 PCR鑒定重組子

對于雙酶切鑒定的陽性重組子(5#、7#)進行PCR鑒定，模板是質粒 AHRDtkLUC3，鑒定結果見圖4。

M.DL2000 C.對照 1.5#重組子 2.7#重組子

2.5 DNA 序列測定

AHRDtk序列：

GGATCCCCTGAGGCTAGCGTGCGTAAGCCTGCTCCATCCTCTGGGGGCAG

AGGTCGGGCTGCCTGTCTCCGCCCCACCTGGCTGGGGACAAGGTGCCCCG

GAGTTGCGTGAGAAGAGCCTGGAGGCCCGCGCAGCCACCCAGCTACCCA

ACTCACAACCGGGCGCGGGTCCCAGTGCTGTCACGCTAGCTGGGGGAGGG

GAACCGTGGGTGAGGCTCTTAAGGGGATCGAGCTCTTACGCGTGCTAGTC

TAGATTCGAACACGCAGATGCAGTCGGGGCGGCGCGGTCCGAGGTCCACT

TCGCATATTAAGGTGACGCGTGTGGCCTCGAACACCGAGCGACCCTGCAG

CGACCCGCTTAACAGCGTCAACAGCGTGCCGCAGATCTGCGATCTAAGTA

AGCTT

DNA序列測序正確，大量制備載體DNA，用于轉化斑馬魚卵。

2.6 顯微注射載體DNA，傳代篩選得到受AHRE元件控制的GFP轉基因斑馬魚

2.7 討論

本研究構建的轉基因斑馬魚報告系統，利用AHRDtk元件響應TCDD污染物，調控綠色熒光蛋白(EGFP)的表達，因此斑馬魚體內EGFP的表達反映了AHRDtk元件的活性，從而可以反映水環境中的TCDD污染狀況。當水環境中含有TCDD時，這些物質與轉基因斑馬魚中的AHRDtk順式作用元件結合，啟動EGFP基因的表達，通過熒光顯微鏡能觀察到轉基因魚出現綠色熒光；而當水環境中不含TCDD時，EGFP不能被激活，不能觀察到轉基因魚的綠色熒光。因此，這種轉基因魚可用于TCDD類污染物的水環境檢測。

本研究采用顯微注射的方法獲得轉基因斑馬魚，為提高胚胎的存活率和獲得第一代轉基因魚的總效率，需要用保證DNA 最佳純度的標準方法制備線形DNA片斷。轉基因整合的效率取決于注射的DNA 濃度，而卵的存活能力與DNA 濃度則呈相反的關系[8]。因此，需在胚胎存活與整合效率之間尋求平衡兼顧。控制注射到細胞的DNA量是通過DNA 濃度而不是注射DNA 溶液的體積來調節。為代償注射到大體積的細胞質導致DNA 的稀釋、使注射的DNA 進入細胞核達到適當的概率，而同時也使注射后的胚胎維持令人滿意的存活率，DNA通過微量移液管反填裝入注射針。注意不要引入氣泡，以免干擾DNA的流速。

一般認為，外源基因在受精卵中的整合發生在胚胎的晚期，原腸末期之前胚胎的核酸酶系統發育不完善，外源基因的復制速度大于降解速度，大量的外源基因積累在胚胎內[9]；原腸末期之后，外源基因的數量逐步減少，最終只有少量整合到基因組。如果外源基因在原腸末期之前表達，會產生過量的外源蛋白，干擾胚胎的正常發育，可導致高死亡率。所以轉基因斑馬魚的熒光穩定性，與其表達時期、表達量相關。轉基因斑馬魚體內積聚一定的毒素后就會發光，不過目前的轉基因斑馬魚發出的光還比較微弱。

3 結論

利用轉基因技術成功建立了一套綠色熒光蛋白(GFP)轉基因斑馬魚毒物檢測系統。選用AHRDtk片段和pFRMwg+plasmid 載體，通過酶切、連接和PCR鑒定等程序成功構建載體DNA，然后通過顯微注射轉入斑馬魚，經不斷傳代和篩選得到穩定的受芳香烴反應元件AHRE控制的轉基因斑馬魚，可用于水環境中毒物的檢測。

參考文獻：

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[9] Chen S L,Hong Y H,Schartl M.Development of a positive-negative selection procedure for gene targeting in fish cells[J].Aquaculture,2002,214(1-4):67-69.