聚乙二醇對溶菌酶熱變性過程影響的DSC研究

我國著名生物化學(xué)家吳憲教授早在1931年就首先提出了蛋白質(zhì)變性的概念[1]，作為從分子水平闡明生命奧秘的中心課題之一，蛋白質(zhì)去折疊的研究一直受到生物化學(xué)、生物物理學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域研究工作者的關(guān)注[2,3]。在蛋白質(zhì)變性過程中，維系其空間結(jié)構(gòu)的次級鍵被破壞，伴隨著焓、熵的顯著變化[4,5]。研究蛋白質(zhì)在不同條件下的變性過程，對于理解具有一定氨基酸序列結(jié)構(gòu)的多肽鏈如何逐步卷曲形成具有特定空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子具有重要意義[6,7]。

細(xì)胞體系極其復(fù)雜，細(xì)胞內(nèi)含有大量可溶或者不可溶的大分子物質(zhì)，如多糖、蛋白質(zhì)、核酸等，它們以不同的濃度而存在[8～10]，這些不同種類的大分子物質(zhì)占據(jù)了細(xì)胞總體積的20%～30%，大多數(shù)的生命化學(xué)反應(yīng)正是在這種極其擁擠的環(huán)境體系中完成的。 但長期以來蛋白質(zhì)去折疊的研究均是在簡單的緩沖體系——稀溶液中進(jìn)行的。簡單的稀溶液并不能真實(shí)反映胞內(nèi)蛋白質(zhì)的去折疊過程。因此，模擬細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境，盡可能地在接近真實(shí)的細(xì)胞體系中進(jìn)行體外研究十分必要，近幾年已有相關(guān)的報(bào)道[11～15]。一些高分子聚合物，如聚乙二醇(PEG)和葡聚糖等常被用作擁擠試劑模擬細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境，進(jìn)而改善蛋白質(zhì)的生物活性[16～18]或藥物的利用程度[19]。

作者以PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG20 000作為擁擠試劑，利用DSC研究了聚乙二醇對溶菌酶熱變性過程的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑及儀器

溶菌酶為凍干粉末，Genview公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)用水為去離子蒸餾水，所有試樣溶液均用緩沖溶液配制。

日立U-3310型紫外可見分光光度計(jì)，Hitachi公司；Micro-DSCⅢ型微量熱儀,法國Setaram公司。

1.2 方法

將溶菌酶溶于不同質(zhì)量濃度(0～350 g·L-1)的PEG溶液中，酶的濃度均為0.5 mmol·L-1。用微量熱儀記錄各樣品的熱轉(zhuǎn)變曲線，儀器工作溫度范圍253～393 K，溫度精確度10-4K，熱流精度10-4mW，升溫速率在0.01～1.2 K·min-1范圍內(nèi)無級可調(diào)。實(shí)驗(yàn)設(shè)定升溫速率為0.15 K·min-1。實(shí)驗(yàn)取Tm為變性溫度，ΔH為變性焓。

酶濃度通過用紫外可見分光光度計(jì)測定280 nm下的吸光度值而計(jì)算得到。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚乙二醇對溶菌酶變性溫度的影響

分別考察了不同濃度PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG20 000對溶菌酶熱變性時(shí)變性溫度Tm的影響，結(jié)果見表1。

表1 溶菌酶在不同PEG及濃度下的變性溫度

由表1可以看出，熱變性時(shí)溶菌酶的變性溫度Tm隨著PEG質(zhì)量濃度的增加而降低，且Tm值與PEG的分子質(zhì)量息息相關(guān)。當(dāng)用PEG2000作為擁擠試劑時(shí)，其Tm值變化最大，由350.35 K降至343.75 K；當(dāng)用PEG20 000作為擁擠試劑時(shí)，其Tm值變化最小，由350.35 K降至345.45 K。在同一質(zhì)量濃度下，溶菌酶的Tm與PEG的分子質(zhì)量成正比關(guān)系，即PEG的分子質(zhì)量越大，變性溫度Tm越高。對于同一分子質(zhì)量的PEG 來說，變性溫度Tm與PEG的質(zhì)量濃度(c)基本呈線性關(guān)系，且線性度較好，R2值均大于0.9910。

PEG2000：Tm=-0.1842c+350.019R2=0.9926

PEG4000：Tm=-0.1670c+350.064R2=0.9910

PEG6000：Tm=-0.1535c+350.200R2=0.9950

PEG20 000：Tm=-0.1316c+350.284R2=0.9946

2.2 聚乙二醇對溶菌酶變性焓的影響

分別考察了不同濃度PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG20 000對溶菌酶熱變性時(shí)變性焓ΔH的影響，結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出,整個(gè)實(shí)驗(yàn)中PEG的分子質(zhì)量及質(zhì)量濃度對變性焓ΔH的影響較小，ΔH維持在(515.95±28.75) kJ·mol-1之間，基本為一定值。

3 結(jié)論

探討了擁劑試劑PEG及濃度對溶菌酶熱變性過程的影響。結(jié)果表明，變性溫度Tm隨著PEG質(zhì)量濃度的增加而降低，且基本呈線性關(guān)系。在同一質(zhì)量濃度下，Tm的大小與PEG的分子質(zhì)量成正比關(guān)系，即PEG的分子質(zhì)量越大，變性溫度Tm越高。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中PEG的分子質(zhì)量及質(zhì)量濃度對變性焓ΔH的影響較小，ΔH維持在(515.95±28.75) kJ·mol-1之間，基本為一定值。

表2 溶菌酶在不同PEG及濃度下的變性焓

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