N+離子注入選育高轉化15α-羥基左旋乙基甾烯雙酮雷斯青霉菌株的研究

離子注入技術作為一種特殊的物理化學復合誘變源，自1986年余增亮等將其應用于生物學以來，在生物批種改良領域已取得了豐碩成果[1]。作為一種新的誘變源，低能離子注入和常規的輻射誘變及化學誘變有著明顯的差異，常規的輻射誘變僅僅是利用能量交換，化學誘變考慮的也只是分子基團的交換，而低能離子注入生物體時同時存在能量交換、能量沉積、質量沉積及電荷交換四大效應。由于注入離子的電荷數、質量數、能量、劑量的組合不同，可以提供眾多的誘變條件，使離子注入誘變具有突變譜寬、突變率高的特點，從而可以篩選到符合生產要求、能夠提高產量的突變體[2,3]。

15α-羥基左旋乙基甾烯雙酮是合成孕二烯酮(Gestodene)的重要中間體[4]，其核心技術是在左旋乙基甾烯雙酮的C15位上連接一個α-羥基[5]，而雷斯青霉是對左旋乙基甾烯雙酮進行C15α位羥化的常用菌株[6,7]。

作者采用N+離子注入技術對雷斯青霉(Penicilliumraistrickii)ATCC 10490進行誘變處理，以期得到適于工業生產的高轉化率突變株，并考察該技術在霉菌選育方面的應用價值。

1 實驗

1.1 菌種

雷斯青霉(Penicilliumraistrickii)ATCC 10490，美國菌種保藏中心。

1.2 培養基

固體培養基(g·L-1)：麥芽提取物 20，葡萄糖 20，蛋白胨 1，瓊脂粉 20，pH值自然。

液體培養基(g·L-1)：葡萄糖 30，玉米漿 10，NaNO32，KH2PO41，K2HPO40.5，MgSO40.5，FeSO40.02，KCl 0.5，pH值自然。

1.3 雷斯青霉孢子懸液的制備

在無菌條件下，挑取雷斯青霉菌種沙土孢子適量，均勻接種在斜面培養基表面。置于28℃恒溫培養5～7 d。取新鮮的雷斯青霉孢子斜面一支，加入10 mL無菌生理鹽水，洗脫孢子，移入裝有滅菌玻璃珠的三角瓶內，振蕩30 min，雙層紗布過濾，得到無菌絲體的孢子懸液。調整孢子濃度為1×107個·mL-1，取上述單孢子懸浮液0.1 mL，均勻涂布于90 mm的滅菌培養皿中間區域，無菌風吹干。

1.4 低能離子注入

將含有雷斯青霉孢子的培養皿放入低能加速器(離子注入機)靶室，打開培養皿蓋，靶室抽真空。用能量為30 keV的不同劑量的N+離子束進行注入。用1 mL無菌生理鹽水洗脫，適當稀釋后涂布在平板培養基上，于28℃培養2 d，用于單菌落的挑選和存活率的計算。

1.5 左旋乙基甾烯雙酮15α-羥化實驗

孢子斜面用無菌水制成孢子懸浮液，濃度為1.5×107個·mL-1，按3%接種量接入裝有50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，置于28℃、180 r·min-1的搖床上培養42 h后，按3‰的投料量加入左旋乙基甾烯雙酮和6%的甲醇，繼續轉化培養120 h。

1.6 分析檢測

不同時間取500 μL發酵液于離心管中，加入等體積乙酸乙酯萃取30 min，12 000 r·min-1離心5 min,取上清液100 μL，揮干乙酸乙酯，加入1000 μL甲醇溶解，用高效液相色譜法進行檢測。高效液相色譜條件：C18柱(4.6 mm×250 mm)，流動相為甲醇∶水(80∶20)，流速1 mL·min-1，檢測波長241 nm。

2 結果與討論

2.1 離子注入誘變對雷斯青霉存活率和突變率的影響(圖1、圖2)

由圖1可知，設定靶室抽真空時菌株的存活率為100%，隨著N+注入劑量增加，存活率呈現較明顯的先降后升再降的“馬鞍型”變化趨勢，這種特有的變化被認為是能量、動量作用下的損傷效應和質量、電荷作用下的保護和刺激綜合作用的結果。

由圖2可知，N+注入劑量為50×1014ions·cm-2時正突變率最高，達14.5%，恰好在“馬鞍型”區域內。超過50× 1014ions·cm-2后，菌株突變率繼續增加，而正突變率明顯下降，這可能是因為，隨著N+注入劑量的增大，DNA和生物膜等損傷嚴重導致。

圖1 N+輻照的存活效應

圖2 N+離子注入對菌株突變率及正突變率的影響

2.2 離子注入誘變對雷斯青霉菌落形態的影響

考察了N+注入劑量為50×1014ions·cm-2時菌株的變化情況，結果見圖3。

圖3 離子注入誘變后雷斯青霉的菌落形態

由圖3可知，在50×1014ions·cm-2N+劑量下出現了5種不同菌落形態。搖瓶轉化實驗表明，3株突變株(突變株1、3、4)的轉化率高于出發菌株。其中突變株1轉化率最高，其單菌落形態較大，菌絲體呈白色，且生長旺盛，孢子呈深綠色且量大，菌落平整，無褶皺，邊緣整齊，明顯不同于其它突變株。由此可見，可以通過菌落形態的差異初步判斷轉化率可能較高的菌株，為雷斯青霉提供了良好的初篩方法。

在液體培養基中，突變株1的孢子發芽時間要比出發菌株短，搖瓶培養12 h時，可以觀察到孢子發芽后菌絲較出發菌株更長，繼續搖瓶培養至24 h時，突變株1的菌絲球量明顯高于出發菌株，說明其對營養成分的利用更迅速，生長速度快于出發菌株，見圖4。

圖4 出發菌株與突變株1的菌絲照片

出發菌株和突變株1的生長曲線見圖5。

圖5 出發菌株與突變株1的生長曲線

由圖5可知，突變株1的對數期較短，孢子接種后42 h菌體量達到最大值，較出發菌株提前5 h達到穩定期。

2.3 高轉化率菌株的分離

將突變株1進行平板分離純化，挑選10株進行搖瓶轉化實驗，結果如表1所示。

表1 突變株1分離純化菌株轉化性能

由表1可知，其轉化率均高于55%，其中突變株50A-8的轉化率達到62.7%。

2.4 突變株的穩定性實驗

對轉化性能最好的突變菌株50A-8連續傳代，考察其遺傳穩定性。結果表明，該菌株的遺傳性能比較穩定。傳代至第8代時，轉化率為61.4%，第9代為61.2%。

3 結論

雷斯青霉孢子經N+離子注入技術誘變后，其存活率呈典型的“馬鞍型”曲線，最適N+注入劑量為50×1014ions·cm-2，在該劑量下呈現出不同的菌落形態，從其中菌絲生長旺盛、孢子量較大的菌落中篩選到一高轉化率突變株50A-8，該突變株對左旋乙基甾烯雙酮的轉化率可達62.7%，為出發菌株的1.16倍，且遺傳穩定性良好。

參考文獻：

[1] 余增亮．離子束與生命科學一個新的研究領域[J]．物理，1997，26(6)：333-338．

[2] 袁成凌，余增亮．低能離子束在生物技術中的應用研究[J]．中國生物工程雜志，2003，23(4):57-61.

[3] 陳宇，林梓鑫，張峰，等．離子注入微生物的生物效應研究[J]．中國抗生素雜志，1998，23(6)：415-419．

[4] Schlosser D，Irrgang S,Schmauder H P.Steroid hydroxylation with free and immobilized cells ofPenicilliumraistrickiiin the presence ofβ-cyclodextrin[J]．Applied Microbiology and Biotechnology,1993，39(1):16-20．

[5] Irrgang Sylke，Schlosser Dietmar,Fritsche Wolfgang．Involvement of cytochrome P-450 in the 15α-hydroxylation of 13-ethyl-gon-4-ene-3，17-dione byPenicilliumraistrickii[J]．Steroid Biochem Mol Biol,1997，60(5):339-346．

[6] Irrgang S，Schlosser D,Schmauder H P．The steroid 15α-hydroxylase ofPenicilliumraistrickiiI 477 is inducible[J]．Biotechnology Letters，1992，14(1):33-38．

[7] Schlosser D，Irrgang S，Schmauder H P．Morphological characterization of microenc apsulatedPenicilliumraistrickii477[J]．Acta Biotechnologica，1993，13(2):123-129．