T-2毒素人工抗原的制備

T-2毒素(T-2 Toxin)是一種真菌毒素，屬于單端孢霉烯族化合物中的A族，是該類化合物中毒性最強的毒素之一，主要由三線鐮刀菌、梨抱鐮刀菌、擬枝抱鐮刀菌和木賊鐮刀菌等霉菌產生。T-2毒素為白色針狀結晶，熔點150～151℃，難溶于水，易溶于極性溶劑，如三氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯等。烹調過程不易將其破壞。分子式為C24H34O9，分子量為466。基本結構為四環的半倍萜，C-9和C-10位上有不飽和雙鍵，在紫外燈下不顯熒光。T-2毒素的分子結構見圖1[1]。

R1=OH R2=R3=OAc R4=OCOCH2CH(CH3)2

目前國內外T-2毒素的檢測方法有很多種，其中TLC法用目測半定量,靈敏度不高,不適于檢測大量樣品，選擇性和敏感性也低，近年來應用較少。LC、GC是定量的檢測方法，結果準確可靠，但檢出限較高，且所用儀器設備較為昂貴。ELISA法是一種準確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大量樣品的快速篩選。為了開發ELISA法，必須首先制成 T-2毒素抗原 。目前，國外合成T-2完全抗原的常用方法主要包括琥珀酸酐(HS)法 、戊二酸酐(HG)法和羧甲基肟(CMO)法[2]，其中羧甲基肟法試劑較貴，琥珀酸酐法和戊二酸酐法比較常用。作者在此對琥珀酸酐(HS)法做了改進，成功合成了T-2毒素完全抗原，為獲得T-2毒素單克隆抗體奠定了基礎。

1 實驗

1.1 試劑及儀器

牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)、卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)、T-2毒素、碳二亞胺(EDPC),Sigma公司；琥珀酸酐(HS)，中國醫藥集團上海化學試劑公司；GF254，青島海洋化工廠；羥甲基纖維素鈉(CMCNa)、二甲基酰胺(DMF)、三氯甲烷、甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、氯化鈉、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉，國藥集團化學試劑有限公司。

CO2恒溫培養箱(氣套式)，Binder；振蕩器，海門其林貝爾儀器制造有限公司；酶標板(96孔)，金燦華實業有限公司；紫外分光光度計、小型高速離心機，德國Eppendorf；超凈工作臺，哈爾濱東聯；核酸電泳儀，六一儀器廠；Alpha Imager 2200型凝膠成像系統，美國Alpha Innotech Corporation；ELX800型酶標儀，美國Bio-Tek公司；Astell高壓滅菌鍋，Mettler。

1.2 T-2HS的制備

參照文獻[3]，將2 mg T-2毒素和42 mg琥珀酸酐置于0.8 mL吡啶中，在蒸氣浴中反應4 h。然后將反應混合物于氮氣下吹干干燥，再溶于適量氯仿。用蒸餾水洗 4次，將氯仿抽提物蒸發干燥,得T-2HS,用TLC法[以乙酸乙酯∶ 丙酮∶甲醇 (50∶50∶1)為展開劑]檢測。

1.3 T-2BSA偶聯物的制備

將2 mg T-2HS用0.2 mL二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制得A液；將5 mg BSA、3 mg EDPC加25 mL蒸餾水溶解，制得B液；將A液逐滴加入B液中，邊加邊攪拌，10 min后，加1 mg EDPC，室溫、pH值5.5條件下繼續攪拌18 h，然后用PBS溶液(0.01 mol·L-1，pH值7.2)透析3 d，每天換液一次。透析后，分裝冷凍干燥保存。

1.4 T-2OVA偶聯物的制備

將2 mg T-2HS用0.2 mL二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制得A液；將5 mg OVA、3 mg EDPC加25 mL蒸餾水溶解，制得B′液；將A液逐滴加入B′液中，邊加邊攪拌，10 min后，加1 mg EDPC，室溫、pH值5.5條件下繼續攪拌18 h，然后用PBS溶液(0.01 mol·L-1，pH值7.2)透析3 d，每天換液一次。透析后，分裝冷凍干燥保存。

1.5 偶聯比的計算

對于大分子和小分子的偶聯物，由于兩種分子均有各自不同的最大紫外吸收峰，根據波長疊加原理，偶聯物應有不同的紫外吸收峰，且在最大吸收峰波長處的吸光度值與其相應的濃度成比例，但在偶聯物的紫外掃描光譜中，則表現為各自的光譜圖呈疊加性質。該法操作簡單且無樣本損耗[4]。實驗所用 T-2HS的濃度為 1 mg·mL-1，BSA和OVA濃度均為1 mg·mL-1。T-2BSA和T-2OVA的濃度為0.5 mg·mL-1，偶聯比c1/c2計算如下∶

KAxm=AAxm/(ρx/Mx)

KBxm=ABxm/(ρx/Mx)

式中：c1、c2為偶聯物中A、B兩種物質分子濃度比；AAam、ABam和ACam分別為毒素、蛋白、偶聯物在小分子毒素T-2HS特征吸收波長處的紫外吸光值；AAbm、ABbm和ACbm分別為毒素、蛋白、偶聯物在蛋白質特征吸收波長處的紫外吸光值；x=a、b，分別代表毒素、蛋白；ρ為濃度，M為摩爾質量。

2 結果與討論

2.1 T-2與HS的連接

由TLC可以得到，T-2的Rf=0.729，T-2HS的Rf=0.705，其中T-2的Rf大于T-2HS的Rf值，說明T-2與HS 連接成功，可以繼續與蛋白OVA和BSA連接。

2.2 T-2HS與蛋白的連接

對T-2HS與蛋白的偶聯物進行紫外掃描，結果見圖2、圖3。

圖2 T-2、T-2HS、BSA和T-2BSA的紫外掃描圖譜

由圖2可以看出，T-2的紫外吸收峰在190 nm左右，T-2HS的紫外吸收峰在209 nm，BSA的紫外吸收峰在275 nm，此處T-2有弱吸收，偶聯物T-2BSA的紫外吸收峰在276 nm左右，推測為載體和偶聯于載體上的蛋白的吸收累加所致，表明T-2毒素連接到了載體蛋白上，全抗原合成成功。T-2BSA和BSA的最大吸收峰分別在波長276 nm和275 nm處。計算T-2與BSA的偶聯比是6.66∶1。

圖3 T-2、T-2HS、OVA和T-2OVA的紫外掃描圖譜

由圖3可以看出，T-2的紫外吸收峰在190 nm左右，T-2HS的紫外吸收峰在209 nm，OVA的紫外吸收峰在278 nm，偶聯物T-2OVA的紫外吸收峰在277 nm左右，此處T-2沒有峰，說明該峰是由OVA貢獻，表明T-2毒素接到了載體蛋白上，全抗原合成成功。T-2OVA和OVA的最大吸收峰分別在波長277 nm和278 nm處。計算T-2與OVA的偶聯比是10.11∶1。

對T-2HS與蛋白的偶聯物進行電泳分析，結果見圖4。

1.Marker 2.BSA 3.T-2BSA 4.OVA 5,6.T-2OVA

由圖4可以看出，偶聯物T-2BSA分子量略大于BSA分子量，說明T-2BSA偶聯成功。T-2OVA分子量大于OVA分子量，說明T-2OVA偶聯成功。

2.3 討論

T-2毒素屬于倍半萜烯類化合物，是含有羥基的小分子半抗原，其本身不具有免疫原性，不能像細菌等天然抗原一樣可單獨用于動物免疫，刺激其產生特異性抗體。因此，獲得T-2抗體的關鍵是將T-2半抗原與蛋白質大分子偶聯，轉變成 T-2完全抗原。本實驗采用琥珀酸酐法制備T-2毒素抗原，即T-2BSA和T-2OVA，預備用來免疫動物以獲得 T-2抗體。

通過紫外和SDS聚丙烯酰胺電泳分析確定人工抗原的分子量。由于半抗原抗體的特異性不僅取決于半抗原整個分子或部分結構的性質，還與其人工抗原中載體上連接的半抗原數目有關，因此在免疫前測定偶聯比，即合成的人工抗原載體上連接的半抗原數目，具有特殊意義。本實驗在合成方法上采用氮氣吹干避免氧化，能夠較好地制備人工抗原，偶聯比較好，一般來說當半抗原與載體的偶聯比為(3～45)∶1 時免疫原性較強,在(8～25)∶1時能得到效價較高的抗體[5]。本實驗合成的人工抗原T-2BSA和T-2OVA的偶聯比為 6.66∶1和10.11∶1，為進一步研究奠定了基礎。

3 結論

在蒸氣浴條件下，T-2毒素與琥珀酸酐(HS)反應合成了T-2HS，薄層層析顯示，目標半抗原合成成功；然后通過碳二亞胺法將半抗原與載體蛋白偶聯制備人工抗原，采用紫外掃描及SDS-PAGE鑒定。結果顯示，T-2HS能與牛血清白蛋白和卵清蛋白結合生成T-2毒素抗原。紫外掃描分析表明，T-2毒素與牛血清白蛋白的偶聯比為6.66∶1，與卵清蛋白的偶聯比為10.11∶1，表明此完全抗原能夠用于免疫動物。為進一步制備T-2毒素抗體奠定了基礎。

參考文獻：

[1] Bsuer J.The metabolism of trichothecenes in swine[J].Dtsch Tierarztl Wochenschr,1995，102(1):50-52.

[2] 唐小波.制備T-2毒素抗體方法研究進展[J].中國地方病學雜志，1998，17(2):124-126.

[3] Zhang Guang-shi,Schubring Susan L,Chu F S,et al.Improved method for production of antibodies against T-2 toxin and diacetoxyscirpenol in rabbits[J].Applied and Environmental Microbiology,1986,51(1):132-137.

[4] Altieri S L,Khan A,Nazmul H,et al.Exosomes from plasmacytoma cells as a tumor vaccine[J].J Immunother,2004,27(4):282-288.

[5] Erlanger B F.The preparation of antigenic hapten-carrier conjugate：A survey[J].Methods in Enzymology,1980，70:70-74.