產脫鹵酶菌株的篩選及其應用

脫鹵酶是能催化鹵族離子從鹵代有機化合物上釋放出來的酶。通過對鄰位鹵代醇的催化作用，可以使鄰位鹵代醇脫去鹵族離子，形成相應的環氧化合物。具有單一光學構象的環氧化合物在藥物合成中有很重要的作用，鹵代醇被認為是合成環氧化合物的重要中間體[1]。近年來，環氧化合物通常經由化學法合成[2～4]，而脫鹵酶生物催化合成環氧化合物的研究較少。據文獻報道，研究比較廣泛的脫鹵酶主要是α-氯丙酸(α-CPA)脫鹵酶[5，6]以及鹵烷脫鹵酶[7]。目前尚沒有關于篩選產鹵代醇脫鹵酶菌種的相關文獻報道。

鹵代醇脫鹵酶是一種細菌酶，可以催化鄰位鹵代醇轉化為相對應的環氧化合物。酶促鹵代醇脫鹵反應的一般反應機理[8]是基于有效序列與脫鹵酶/水解酶短鏈的相似性，已通過對剩余催化劑殘基進行定點誘變所證實。這一機理從根本上區別于水解作用的脫鹵酶機理是其不包括酶-底物的共價中間體。另外，鹵代醇脫鹵酶可通過對映體選擇性開環催化動力學拆分外消旋的環氧化物，這為制備具有光學活性的化合物提供了一種新的策略。

作者以氯乙酸作為唯一碳源，從土壤樣本中篩選得到能通過酶促反應將β-溴對硝基苯乙醇轉化為對硝基環氧苯乙烯(圖1)的高產脫鹵酶菌株，并優化了發酵培養基和轉化條件。

圖1 酶催化β-溴對硝基苯乙醇轉化為對硝基環氧苯乙烯的反應式

由于底物β-溴對硝基苯乙醇以及誘導物氯乙酸均有毒性，可能會抑制細胞大量生長，這也成為本課題的難點。

1 實驗

1.1 培養基、試劑和儀器

篩選培養基(g·L-1):Na2HPO43.2， KH2PO41.5，酵母5,氯乙酸2, MgSO498 mg，CaCl210 mg， FeSO41 mg，ZnSO40.1 mg。250 mL三角瓶裝入30 mL培養基，121℃滅菌20 min。

平板培養基(g·L-1):蛋白胨10，酵母5，NaCl 10，瓊脂20，氯乙酸2，pH值7.0。121℃滅菌20 min，每個平板倒入10 mL培養基。

發酵培養基(g·L-1):Na2HPO43.2，KH2PO41.5，酵母5,蛋白胨2.5，氯乙酸2,MgSO498 mg，CaCl210 mg，FeSO41 mg，ZnSO40.1 mg。每支試管裝入5 mL培養基，121℃滅菌20 min。

轉化液:將β-溴對硝基苯乙醇溶解在去離子水中，配成5 g·L-1的水溶液，即為轉化液。每支試管裝入5 mL轉化液，121℃滅菌20 min。

酵母、蛋白胨，生化試劑，Oxoid；乙腈、甲醇，色譜純，Dikma。

LC-20AT型高效液相色譜儀，日本島津；Diamonsil C18柱，250 mm×4.6 mm×5 μm。

色譜條件：流動相為0.05 mol·L-1的醋酸鈉∶乙腈(80∶20，體積比)，流速1 mL·min-1，檢測波長310 nm。

1.2 初篩

稱取土壤樣本各0.1 g，加入無菌水10 mL，搖勻后制成土壤樣本菌懸液，取上清液5 mL，添加到以氯乙酸為唯一碳源的篩選培養基中，在30℃、220 r·min-1條件下振蕩培養48 h。挑取培養液，在平板上劃線分離，30℃溫箱培養。將平板上生長的不同菌落挑取一環后接種到發酵培養基，在30℃、220 r·min-1條件下振蕩培養48 h。將5 mL培養液離心分離得到菌體，加入轉化液中，在30℃、220 r·min-1條件下振蕩轉化48 h。用硝酸銀沉淀法初步檢測是否有轉化反應(出現淺黃色沉淀即表示可以轉化β-溴對硝基苯乙醇)。

1.3 復篩

將菌種保存斜面上的初篩菌株挑取一環接種到裝有5 mL發酵培養基的試管中，30℃、220 r·min-1培養48 h，轉接到裝有30 mL發酵培養基的三角瓶中，30℃、220 r·min-1培養48 h。將30 mL發酵液離心得到菌體，加入5 mL轉化液轉化12 h。用HPLC測定轉化率。

1.4 菌株17#的液體培養與預處理

將菌種保存斜面上的菌株17#挑取一環接種到裝有5 mL發酵培養基的大試管中，30℃、220 r·min-1培養48 h，轉接到裝有30 mL發酵培養基的三角瓶中，30℃、220 r·min-1培養48 h。將30 mL發酵液以12 000 r·min-1離心3 min，棄去上清液，用5 mL pH值7.0磷酸緩沖溶液清洗菌體，振蕩，離心后棄去上清液，得到菌體。

1.5 完整細胞轉化β-溴對硝基苯乙醇

將菌體加入到轉化液中，振蕩均勻，空白對照不加菌體。30℃、220 r·min-1轉化12 h后，12 000 r·min-1離心3 min，取轉化液用HPLC測定轉化率。

1.6 分析測試

鹵代醇脫鹵酶催化β-溴對硝基苯乙醇轉化為對硝基環氧苯乙烯，會生成等摩爾的溴化氫，可以通過酚紅分光光度法測定轉化液中溴離子的濃度，從而確定酶活力。

酶活力單位定義為30℃、220 r·min-1的轉化條件下，1 h內轉化1 μgβ-溴對硝基苯乙醇所需的菌體干重為一個酶活力單位。

2 結果與討論

2.1 菌種的篩選

以氯乙酸作為唯一碳源，從采集的土壤樣本中篩選出73株可將β-溴對硝基苯乙醇轉化為對硝基環氧苯乙烯的菌株。利用硝酸銀沉淀反應定性檢測，得到具有不同轉化能力的菌株共52株，利用HPLC測定轉化率，從中挑選出轉化率最高的菌株17#，進行后續實驗。

2.2 培養條件的研究

2.2.1 碳源對酶活力及生物量的影響

選擇濃度為2.5 g·L-1的蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、葡萄糖、木糖、果糖替代發酵培養基中的蛋白胨，考察碳源對酶活力和生物量的影響，結果見表1。

表1 碳源對酶活力和生物量的影響

由表1可知，不同的碳源對酶活和生物量的促進作用不同，以乳糖為碳源時，酶活最高，達到36.7 U·mg-1。因此，選擇乳糖作為碳源。

2.2.2 乳糖濃度對酶活力及生物量的影響

以乳糖作為碳源，考察乳糖濃度對酶活力和生物量的影響，結果見表2。

表2 乳糖濃度對酶活力和生物量的影響

由表2可知，當乳糖濃度為8 g·L-1時，酶活力達到最高，為68.22 U·mg-1。因此，選擇發酵培養基中乳糖的濃度為8 g·L-1。

2.2.3 誘導物的濃度對酶活力及生物量的影響

由于誘導物氯乙酸酸性較強且有毒性，宜盡量選擇較低的濃度。碳源為8 g·L-1的乳糖，考察誘導物氯乙酸的濃度對酶活力和生物量的影響，結果見表3。

表3 誘導物濃度對酶活力和生物量的影響

由表3可知，氯乙酸的濃度為4 g·L-1時，酶活力達到最高，為47.99 U·mg-1。因此，選擇誘導物濃度為4 g·L-1。

2.2.4 氮源對酶活力及生物量的影響

碳源為8 g·L-1的乳糖、誘導物濃度為4 g·L-1，選擇濃度為5 g·L-1的蛋白胨、胰蛋白、硫酸銨、氯化銨代替發酵培養基中的酵母，考察氮源對酶活力和生物量的影響，結果見表4。

表4 氮源對酶活力和生物量的影響

由表4可知，以胰蛋白為氮源時，酶活力達到最高，為113.51 U·mg-1。因此，選擇胰蛋白作為氮源。

2.2.5 胰蛋白濃度對酶活力及生物量的影響

碳源為8 g·L-1的乳糖，以胰蛋白作為氮源，考察氮源濃度對酶活力和生物量的影響，結果見表5。

由表5可知，胰蛋白濃度為6 g·L-1時，酶活力達到最高，為90.09 U·mg-1。因此，選擇發酵培養基中胰蛋白濃度為6 g·L-1。

表5 胰蛋白濃度對酶活力和生物量的影響

2.2.6 金屬離子對酶活力及生物量的影響

在培養基中分別添加濃度為1 mmol·L-1的不同金屬離子，考察其對酶活力和生物量的影響，結果見表6。

表6 金屬離子對酶活力和生物量的影響

由表6可知，除了Cu2+以外，其余金屬離子對菌體的生長都有促進作用，可以顯著提高酶活力；但是添加Cu2+時，酶活力反而下降。因此，培養基中不添加Cu2+。

2.2.7 初始pH值對酶活力及生物量的影響

考察發酵培養基初始pH值對酶活力和生物量的影響，結果見表7。

表7 初始pH值對酶活力和生物量的影響

由表7可知，當初始pH值為6.50時，酶活力達到最高,為84.85 U·mg-1。因此，選擇培養基初始pH值為6.50。

2.2.8 培養溫度對酶活力及生物量的影響

考察發酵溫度對酶活力和生物量的影響，結果見表8。

表8 培養溫度對酶活力和生物量的影響

由表8可知，當培養溫度為30℃時，酶活力達到最高，為125.52 U·mg-1。因此，選擇培養溫度為30℃。

2.2.9 培養時間對酶活力及生物量的影響

考察培養時間對酶活力和生物量的影響，結果見表9。

表9 培養時間對酶活力和生物量的影響

由表9可知，當培養時間為35 h時,酶活力達到最高，為132.80 U·mg-1。因此，選擇培養時間為35 h。

2.3 轉化條件的研究

2.3.1 轉化溫度對轉化率的影響

考察轉化溫度對菌株17#轉化效果的影響,結果見表10。

由表10可知，最適轉化溫度為35℃，此時轉化率達到最高，為90.6%。

表10 轉化溫度對轉化率的影響

2.3.2 轉化時間對轉化率的影響

考察轉化時間對菌株17#轉化效果的影響，結果見表11。

表11 轉化時間對轉化率的影響

由表11可知，最適轉化時間為12 h，此時轉化率雖然由于菌體批次不同的原因略有降低，但仍達87.4%。

3 結論

從土壤樣本中篩選得到產脫鹵酶菌株17#，可以將β-溴對硝基苯乙醇轉化為對硝基環氧苯乙烯。確定最適培養基組成(g·L-1)為：乳糖8，胰蛋白6，氯乙酸4，Na2HPO43.2，KH2PO41.5，MgSO498 mg，CaCl210 mg，FeSO41 mg，ZnSO40.1 mg，pH值6.50;最適培養條件為30℃培養35 h。最佳轉化條件為35℃下轉化β-溴對硝基苯乙醇12 h。菌株17#在最佳培養條件下，酶活力達到最高值132.80 U·mg-1。在最佳轉化條件下的轉化率最高為90.6%。菌株17#能高效地將β-溴對硝基苯乙醇轉化為對硝基環氧苯乙烯，達到了篩選的目的。

參考文獻：

[1] Spelberg J H L,Tang L X,Van Gelder M,et al.Exploration of the biocatalytic potential of a halohydrin dehalogenase using chromogenic substrates[J].Tetrahedron:Asymmetry,2002,13(10):1083-1089.

[2] Bras J L,蔡正艷.烯烴制備β-烷氧基醇的新方法[J].中國醫藥工業雜志，2006，37(8)：549.

[3] 郝小燕，徐巧，李連友，等.水解動力學拆分外消旋環氧氯丙烷—手性單核Salen-Co(Ⅲ)絡合物的制備[J].中國現代應用藥學，2005，22(Z1)：615-616.

[4] 史建俊，吳汝林，劉均洪.環氧化物生物催化轉化的研究進展[J].化工技術與開發，2005，34(6):1-4.

[5] 王能強，吳堅平，王普,等.β-氯丙酸脫鹵酶發酵條件研究[J].工業微生物,2007,37(1):57-61.

[6] 項炯華，吳堅平，王能強,等.2-氯丙酸脫鹵酶產酶菌種的篩選及酶學性質研究[J].化學反應工程與工藝，2005，21(6):537-541.

[7] Bosma Tjibbe,Damborsky Jiri,Stucki Gerhard,et al.Biodegradation of 1,2,3-trichloropropane through directed evolution and heterologous expression of a haloalkane dehalogenase gene[J].Appl Environ Microbiol，2002，68(7)：3582-3587.

[8] Lewandowicz A,Rudzinski J,Tronstas L,et al.Chlorine kinetic isotope effects on the haloalkane dehalogenase reaction[J].J Am Chem Soc,2001,123(19):4550-4555.