阿魏酸與DNA相互作用的光譜電化學研究

DNA是重要的生命遺傳物質和遺傳載體，小分子生物活性物質與DNA相互作用是生物化學研究的前沿領域之一[1，2]，研究DNA與小分子之間的相互作用有助于深刻理解DNA與識別分子或藥物分子的作用機理，對了解藥物的作用機理，進而通過分子設計尋找有效的治療藥物等具有重要意義。凝膠電泳、印跡技術、紫外可見光譜、熒光光譜、原子力顯微鏡等已廣泛應用于這項研究[1～4]。電化學方法[5～8]也越來越多地用于研究電氧化還原物質如抗癌物質與DNA的相互作用。

阿魏酸 (4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，Ferulic acid) 是一種植物多酚，普遍存在于中藥材中，具有抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗氧化和自由基、調節免疫功能、利肝保濕等藥理作用[9～11]。近年來，有關阿魏酸及其衍生物抑制DNA氧化損傷以及結腸癌、直腸癌和舌癌的報道不斷增加[12～14]，其結構如圖1所示。

圖1 阿魏酸的結構式

作者利用多壁碳納米管(MWNT)修飾玻碳電極(MWNT/GCE)研究了阿魏酸與DNA的相互作用，對二者之間的作用機理進行研究，擬為深入了解阿魏酸類藥物的生物活性提供實驗依據。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

阿魏酸溶液的配制：用二次蒸餾水配制成1.00×10-3mol·L-1的儲備液，4℃以下貯存。

小牛胸腺DNA(Sigma)儲備液：用二次蒸餾水配制成8 μg·mg-1的儲備液，4℃以下貯存(小牛胸腺DNA簡寫為DNA)。

B-R緩沖溶液的配制[15]：在100 mL混合液[3.92 mg·L-1H3PO4(2.71 mL·L-185%正磷酸)、2.40 g 乙酸(2.36 mL·L-1冰醋酸)、2.47 g·L-1H3BO3]中，加入0.2 mol·L-1的NaOH溶液40.0 mL，調節pH值為5.72。

其它試劑均為分析純或優級純；二次蒸餾水。

三電極體系：工作電極為玻碳電極(GCE)，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)，對電極為鉑電極；MEC-12B型多功能電化學分析系統(江蘇江分電分析儀器有限公司)；AS3120A型超聲波清洗器；pH-213型酸度計。

1.2 MWNT/GCE的制備

MWNT/GCE的制備參考文獻[16]，將MWNT在濃HCl中超聲7.5 h進行純化，純化后的MWNT加濃HNO3在140℃下回流8 h，水洗至中性，在100℃烘干研成粉末。經濃HNO3回流處理后的MWNT，在打開其端口的同時，引入羧基和羥基官能團。

稱取功能化的MWNT粉末10.0 mg，超聲分散于10 mL水中，形成黑色懸濁液備用。玻碳電極先用0.05 μm Al2O3拋光粉拋光成鏡面，然后分別在無水乙醇和二次水中超聲清洗5 min。用微量進樣器取4 μL懸濁液滴加在玻碳電極表面，紅外燈下烘干，即得MWNT/GCE。

1.3 DNA的變性處理

DNA變性處理參考文獻[17]，將8.0 μg·mg-1DNA置于70～100℃的水浴中約30 min，然后迅速置于冰浴中冷卻，雙鏈DNA (dsDNA)即解鏈變性為單鏈DNA(ssDNA)。

1.4 方法

在10 mL比色管中依次加入pH = 5.72的0.04 mol·L-1B-R緩沖溶液5 mL、1.00×10-3mol·L-1阿魏酸溶液3.0 mL、一定量的dsDNA或ssDNA，定容至10 mL，搖勻，靜置一定時間。采用三電極系統，以0.10 V·s-1的掃描速度在0.8～0.0 V范圍進行循環伏安分析。

2 結果與討論

2.1 阿魏酸和dsDNA相互作用的電化學行為

圖2是在pH=5.72的0.04 mol·L-1B-R緩沖溶液中，阿魏酸與dsDNA作用前后在MWNT/GCE電極上的循環伏安圖。

a.dsDNA b.阿魏酸+dsDNA c.阿魏酸

從圖2可知，含有8 μg·mg-1dsDNA的溶液在0.8～0.0 V范圍內沒有氧化還原峰產生；含有1.00×10-3mol·L-1阿魏酸的溶液在+0.36 V和+0.23 V產生氧化還原峰，峰電位差為13 mV，峰電流比ipa/ipc=0.872，表明阿魏酸電極過程為準可逆。

在阿魏酸中加入dsDNA溶液后，Epc正移，Epa=+0.40 V，Epc=+0.15 V，△Ep為25 mV；峰電流ip顯著下降，表明阿魏酸與dsDNA相互作用時形成電活性較低的復合物。根據峰電位的位移可判斷阿魏酸與dsDNA相互作用模式[18]，峰電位正移、峰電流下降，推測阿魏酸與dsDNA相互作用以嵌插作用為主。

為了進一步探討阿魏酸與DNA的作用機理，將8.0 μg·mg-1dsDNA和8.0 μg·mg-1ssDNA分別與3.0×10-4mol·L-1阿魏酸相互作用，結果見圖3。

a.dsDNA b.阿魏酸+dsDNA c.阿魏酸+ssDNA d.阿魏酸

從圖3可知，dsDNA和ssDNA均使阿魏酸的峰電流降低。但是dsDNA氧化峰電位右移明顯高于ssDNA，且峰電流降低更明顯，這是因為阿魏酸可以平面芳香環嵌插到dsDNA的雙螺旋結構中，電活性降低，而ssDNA不具備雙螺旋結構，其峰電流降低和氧化峰電位正移的原因可能是靜電作用所致。

2.2 DNA與阿魏酸相互作用的紫外吸收光譜

阿魏酸和dsDNA相互作用前后的紫外吸收光譜圖見圖4。

a.dsDNA b.阿魏酸 c～e.阿魏酸+dsDNA

從圖4可知，阿魏酸在310 nm處有特征吸收峰，dsDNA在260 nm 處有最大吸收。在加入dsDNA后,阿魏酸在310 nm處的吸收峰降低，呈減色效應，且出現兩個等電吸收點。鑒于dsDNA在310 nm處幾乎沒有吸收，因此阿魏酸在310 nm處的吸收變化是與dsDNA作用所致，減色效應及兩個等電吸收點是嵌插作用的結果[19]。吸收光譜進一步說明阿魏酸與DNA的相互作用以嵌插作用為主。

2.3 相互作用電子轉移系數α和表觀電子傳遞速率常數ks的測定

電子轉移系數α是電極反應能量勢壘對稱性的量度，對于準可逆體系，根據Laviron理論，應遵循關系式(1)[20，21]：

(1)

式中：Epc為還原峰電位；α為電子轉移系數；n為實際電子轉移系數；k為常數；R為氣體常數；F為法拉弟常數；v為掃描速度，V·s-1。

電子轉移系數α可由Epc～lgv關系曲線的直線斜率求得，還原峰電位Epc和v的常用對數lgv關系曲線的直線斜率應為-2.303RT/αnF。依相關數據求得-2.303RT/αnF為-0.2204。由此得αn=0.27，則n=1時，α=0.27。

表觀電子傳遞速率常數ks可由式(2)[20，21]求得：

(2)

式中:ΔEp為還原峰電位與氧化峰電位的差值。由式(2)求得ks=0.17 s-1，阿魏酸與dsDNA作用前后的電化學參數變化見表1。

表1 阿魏酸與dsDNA作用前后的電化學參數變化

由表1可見，3.0×10-4mol·L-1阿魏酸與8.0 μg·mg-1dsDNA作用后,α、ks值有所下降，說明阿魏酸與DNA的復合物是非電活性的，可能的原因是阿魏酸嵌插到dsDNA的雙螺旋結構中，電活性點被屏蔽，導致電子轉移和傳遞能力降低。

2.4 相互作用的結合常數β和結合數m

根據參考文獻[20，21]計算阿魏酸與DNA相互作用的結合常數β和結合數m。

假定阿魏酸(用A表示)和DNA只形成一種簡單的復合物dsDNA-mA，則反應式和結合常數如下：

dsDNA+mA→dsDNA-mA

(3)

式中:cA0為阿魏酸的初始濃度。經推導可得式(4)：

(4)

式中:Δipa,max為加入dsDNA前后Δipa的最大值。

綜上可知，阿魏酸和DNA之間由于阿魏酸嵌入DNA的堿基對間形成了DNA-阿魏酸的簡單締合物，即1 mol DNA堿基對結合了1 mol的阿魏酸分子。

3 結論

在pH=5.72的B-R緩沖溶液中，阿魏酸和DNA發生嵌插作用形成非電活性的分子化合物DNA-阿魏酸。通過比較電子轉移系數α和表觀電子傳遞速率常數ks的變化，可從理論上說明阿魏酸和DNA發生相互作用；通過紫外吸收光譜分析對二者的嵌插作用進行了驗證。求得阿魏酸和DNA嵌插作用的結合常數β為1.01×104，結合數m≈1。

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