替加氟與牛血清白蛋白相互作用的研究

替加氟(Tegafur，TGF)是一種能阻止腫瘤細胞嘧啶類核苷酸形成的抗代謝藥物，為抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶的衍生物，通過在體內活化為氟尿嘧啶而起作用，是目前臨床廣泛使用并對多種腫瘤具有較好療效的抗腫瘤藥物[1]，其結構見圖 1。

圖1 替加氟的結構式

牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)是血漿中最豐富的載體蛋白,由582 個氨基酸殘基組成,可以與許多內源性或外源性的化合物結合起到存儲與轉運作用，是生物體內重要的藥物小分子結合蛋白[2]。又由于血清白蛋白具有易于分離和提純的特性，因而常被作為模型物質研究生物大分子與藥物小分子之間的相互作用。藥物與血清白蛋白相互作用效應及其結合模式的研究，能從分子水平上獲取藥物在生命體系演變過程中結構和能量轉化的信息，在藥物代謝動力學、最佳用藥量、用藥周期和聯合用藥配比的確定等方面，也具有一定的理論和應用價值[3,4]。作者利用熒光光譜法、圓二色譜法和三維熒光光譜法研究替加氟與牛血清白蛋白的相互作用，獲得其相互作用機理、結合常數、結合力類型等，并考察了替加氟與牛血清白蛋白結合后BSA構象的變化。

1 實驗

1.1 主要試劑及儀器

替加氟(溶液濃度1.0 ×10-3mol·L-1)，中國藥品生物制品檢定所；BSA(溶液濃度2.0×10-6mol·L-1)，Sigma公司；NaCl溶液(0.5 mol·L-1)；Tris-HCl緩沖溶液(pH值7.40)；所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水，經檢測均無熒光雜質。

LS-55型熒光分光光度計(配備有光路長為0.1 cm的比色杯)，美國PE公司；J-810型圓二色譜儀，日本Jasco公司；AY-120M型電子分析天平，日本島津公司；SYC-15型超級恒溫水浴(控溫精度±0.1℃)，南京桑力電子設備廠。

1.2 光譜測定

1.2.1 熒光猝滅光譜

熒光猝滅光譜測定條件：激發波長λex為285 nm、激發狹縫寬度為15 nm、發射狹縫寬度為5.0 nm。用微量進樣器加入不同濃度的替加氟溶液，測定其與牛血清白蛋白相互作用的熒光猝滅圖譜，記錄波長在300～450 nm范圍內的熒光光譜。

1.2.2 三維熒光光譜

三維熒光光譜測定條件：初始激發波長為200 nm，每隔5 nm記錄一次200～500 nm之間的發射光譜，掃描31次，其它參數與熒光猝滅光譜相同。

1.2.3 圓二色譜

圓二色譜(CD光譜)測定條件：比色杯光路長為0.1 cm，掃描速度為200 nm·min-1。在pH值為7.40持續氮流的條件下測定190～270 nm波長范圍內BSA與TGF作用前后的圓二色譜圖，通過Jasco′s Spectra Manager MT軟件來控制。在相同實驗條件下，作為參照物的緩沖溶液從樣品光譜中扣除。實驗數據用MRE(摩爾橢圓率)表示。

2 結果與討論

2.1 熒光猝滅機制和猝滅常數

熒光猝滅過程分為動態猝滅和靜態猝滅，可從溫度影響、粘度影響或熒光壽命等方面加以區分。本實驗根據溫度對猝滅常數的影響來確定猝滅機制。研究表明，對于靜態猝滅過程，其猝滅常數隨溫度的升高而減小，相反，動態猝滅常數隨溫度的升高而增大[5]。因此可以根據不同溫度下BSA與TGF作用時，BSA猝滅常數的變化來區分猝滅類型。pH值等于7.40時，不同濃度的TGF與BSA作用的熒光發射光譜見圖2。

T=298 K；λex=285 nm；c(BSA) =2.0×10-6 mol·L-1;c(TGF)(×10-6 mol·L-1),A～I:0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0

由圖2可知，當激發波長為285 nm時，BSA在350 nm波長處有一個強的熒光發射峰。隨著TGF的不斷加入，BSA的熒光強度逐漸降低，表明TGF是一種有效的熒光猝滅劑，它與BSA發生了締合作用。

為了判斷上述體系的猝滅機制，用經典Stern-Volmer方程[6]分析4個不同溫度下(292 K、298 K、304 K、310 K)的熒光猝滅數據：

F0/F=1+KSVcQ=1+Kqτ0cQ

(1)

式中：F0和F分別表示不存在和存在猝滅劑時生物大分子的熒光強度；KSV為Stern-Volmer 猝滅常數；cQ為猝滅劑的濃度;Kq為生物大分子的猝滅速率常數；τ0為不存在猝滅劑時生物大分子的平均壽命。以F0/F對cQ作圖(如圖3所示)，應用方程(1)計算4個溫度下的猝滅常數KSV，結果見表1。

圖3 4個不同溫度下pH=7.40時的Stern-Volmer關系圖

表1 4個不同溫度下TGF與 BSA 相互作用的Stern-Volmer猝滅常數

由表1可知，猝滅常數KSV隨溫度的升高而降低，298 K時的Kq值遠大于生物大分子的最大分散碰撞猝滅常數(2.0×1010L·mol-1·s-1)[7]，初步判斷實驗中的熒光猝滅是由復合物的生成引起的，為靜態猝滅。

對于靜態猝滅，猝滅數據由修正的Stern-Volmer方程[6]作進一步的分析：

F0/(F0-F)=1/(faKacQ)+1/fa

(2)

式中:fa是熒光基團可接近猝滅劑的部分(分數)；Ka為有效猝滅常數，它近似于TGF-BSA作用體系的結合常數。F0/(F0-F)與cQ的倒數值呈線性關系(如圖4所示)。

圖4 4個不同溫度下pH=7.40時修正的Stern-Volmer曲線

表2 修正的Stern-Volmer方程的相關結合常數與TGF-BSA 體系的相關熱力學參數

比較表1和表2可知，Ka隨溫度的變化趨勢與KSV一致，說明TGF與BSA的結合過程確實為生成復合物的靜態猝滅過程。

2.2 替加氟與BSA的結合模式

一般說來，小分子與生物大分子間的作用力主要包括疏水作用力、氫鍵、Vander Waals力、靜電引力等[8]。假如焓變(ΔH)在所研究的溫度范圍內變化不大，其值可近似為常數，于是熵變(ΔS)由Van′t Hoff方程確定：

1nK=-ΔHθ/RT+ΔSθ/R

(3)

式中：K為相應溫度下的結合常數；R為摩爾氣體常數。lnK和1/T之間存在很好的線性關系，如圖5所示，焓變(ΔH)和熵變(ΔS)可以分別從方程(3)的斜率和截距中得出。自由能變(ΔG)由下式計算：

ΔGθ=ΔHθ-TΔSθ

(4)

計算結果列于表2。

圖5 BSA與TGF相互作用的范特霍夫曲線

Ross等[9]從大量蛋白質和藥物反應的實驗中總結出了熱力學參數值與作用力間的聯系：ΔH>0、ΔS>0為疏水作用力；ΔH<0、ΔS<0為氫鍵和范德華力；ΔH<0、ΔS>0為靜電引力。同時結合其它文獻[10]的觀點，由焓變(-55.00 kJ·mol-1)和熵變(-105.17 J·mol-1·K-1)的值，可知結合過程的主要作用力為氫鍵和范德華力。

2.3 替加氟對BSA構象的影響

2.3.1 圓二色譜

為了研究TGF對BSA構象的影響，測定了室溫條件下BSA和TGF-BSA體系的圓二色譜(CD光譜)，如圖6所示。BSA的α-螺旋結構的定量分析結果也列于圖6。

c(BSA)=2.0×10-6 mol·L-1；c(TGF)(×10-5 mol·L-1),A～C:0,1.0,2.0

由圖6可知，BSA的α-螺旋結構在208 nm和222 nm的紫外區出現兩個負的特征肩峰譜帶 。游離態的BSA中，α-螺旋結構的含量為62.83%，但當BSA 與TGF的濃度比達到1∶10時，這個數值降至56.92% 。表明α-螺旋結構有所伸展，TGF與蛋白質多肽主鏈的氨基酸殘基結合，并且破壞了蛋白質的氫鍵結構。很明顯，TGF的加入導致BSA兩個負的肩峰帶強度明顯減小，但是峰的形狀和峰高位置沒有發生改變。因此，推斷TGF的存在對BSA二級結構有一定的影響，而α-螺旋結構依然占主導地位[11]。

2.3.2 三維熒光光譜

三維熒光光譜不僅可以全面展現待測樣品的熒光信息，而且可以使蛋白質特征構象變化的研究更具科學性和可靠性。它也是另外一種證實BSA構象和微環境是否改變的有效方法。TGF-BSA 體系的三維熒光光譜及數據分析分別見圖7和表3。

c(BSA)=2.000×10-6 mol·L-1;c(TGF)(×10-6 mol·L-1),A:0,B:2.000

表3 BSA和 TGF-BSA復合物的三維熒光光譜特征

由圖7可知，峰a是瑞利散射峰(λex=λem)[12]，它的強度因TGF的加入而增大，原因可能是由于TGF-BSA復合物的生成使得溶液中溶質的直徑增大，散射效應增強。峰b是二級散射峰(λem=2λex) 。峰1(λex=280.0 nm,λem=351.0 nm)顯示了色氨酸和酪氨酸殘基的光譜行為，是研究熒光猝滅時的主熒光峰。此外，還有一個新的強熒光峰2(λex=225.0 nm,λem=351.5 nm)，根據此前的研究結果推測峰2主要顯示多肽主鏈結構的熒光性質，并且該峰的熒光強度與蛋白質的二級結構密切相關[13]，當在蛋白質溶液中加入TGF后，該峰的熒光強度發生了一定程度的猝滅，說明BSA的二級結構發生了變化。結合表3數據及對比圖7A和圖7B可知，加入TGF后峰1和峰2的強度分別猝滅了27.82%和17.18% 。結合CD光譜的結果，得出以下結論：TGF與BSA的相互作用導致部分蛋白質肽鏈發生解旋使蛋白質多肽鏈更加舒展，構象發生改變。

3 結論

在模擬生理條件下，測定不同溫度下TGF對BSA的熒光猝滅圖譜，判斷出該反應為形成復合物的靜態猝滅過程。并由Van′t Hoff方程求得了不同溫度下的熱力學參數。由焓變(-55.00 kJ·mol-1)和熵變(-105.17 J·mol-1·K-1)為負值，推斷出維持復合物穩定的主要作用力為范德華力和氫鍵。計算得到的吉布斯自由能小于零，說明TGF與BSA之間發生了締合作用，且該反應能自發進行。圓二色譜和三維熒光光譜分析發現，在加入TGF之后，BSA中α-螺旋結構的含量減少，部分蛋白質肽鏈發生解旋，BSA的構象和所處的微環境發生了一定程度的改變。

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