高效液相色譜法檢測泰樂菌素殘留

泰樂菌素(Tylosin)是由美國學(xué)者Hamill于1959年自弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)合成并研制得到的十六環(huán)大環(huán)內(nèi)酯抗生素，為畜禽專用抗生素，應(yīng)用廣泛[1，2]。泰樂菌素藥渣是發(fā)酵液預(yù)處理進(jìn)行固液分離時(shí)形成的菌餅部分，其中可被動(dòng)物利用的營養(yǎng)成分很多[3]，但動(dòng)物食用殘留抗生素的藥渣以后，不僅會(huì)破壞動(dòng)物體內(nèi)原有的微生態(tài)平衡、產(chǎn)生耐藥菌，還可通過環(huán)境和食物鏈的作用對(duì)人體健康造成危害。基于以上原因，本課題組篩選出泰樂菌素降解菌處理泰樂菌素藥渣，以使其可代替大豆、玉米等原料生產(chǎn)酵母培養(yǎng)物和飼用酶制劑。我國農(nóng)業(yè)部于2001年發(fā)布《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》中規(guī)定每噸飼料的泰樂菌素添加量(均以有效成分計(jì))是:豬10～100 g，雞4～50 g，連用5～7 d，休藥5 d。

作者在此運(yùn)用高效液相色譜法檢測利用泰樂菌素藥渣生產(chǎn)的酵母培養(yǎng)物和飼用酶制劑中泰樂菌素含量，為開發(fā)利用抗生素藥渣提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要試劑和儀器

泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；甲醇、正己烷、磷酸、十二水磷酸氫二鈉，均為分析純；乙腈、甲醇，色譜純。

LC-8A型高效液相色譜儀、SPD-20A型可變波長紫外-可見檢測器，日本島津公司；TGL-20M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FW177型中草藥粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；DZF-1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS-3B型精密酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；HH.SY21-Ni型電熱恒溫水浴鍋，北京長源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；UV-1100型紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 溶液的配制

泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取適量泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇配成1000 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,4℃避光保存，用0.04 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.5)-乙腈(70∶30)稀釋至適當(dāng)濃度,作為標(biāo)準(zhǔn)工作液,4℃冰箱保存。

磷酸鹽緩沖溶液A：準(zhǔn)確稱取13.4703 g十二水磷酸氫二鈉，溶解，用水稀釋至1 L，磷酸調(diào)節(jié)pH=2.4。

磷酸鹽緩沖溶液B：準(zhǔn)確稱取3.6176 g十二水磷酸氫二鈉，溶解，用水稀釋至250 mL，磷酸調(diào)節(jié)pH=6.5。

1.3 樣品溶液的配制

1.3.1 樣品脫脂

樣品脫脂采用索氏提取法。稱取一定量粉碎后的樣品，用濾紙包好放入索氏提取器中，加入適量正己烷，75℃水浴脫至無色，取出晾干，備用。

1.3.2 樣品的提取

準(zhǔn)確稱取脫脂后樣品1.00 g于50 mL塑料離心管中，加入甲醇10 mL，超聲提取30 min， 4℃、8000 r·min-1離心10 min，移出上清液，殘?jiān)偬崛?次，合并3次提取液， 4℃、4500 r·min-1離心5 min，上清液移入100 mL圓底燒瓶中，35℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至有少量殘?jiān)?用5 mL 0.04 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.5)-乙腈(70∶30)溶解，過0.45 μm濾膜，供高效液相色譜檢測。

1.4 高效液相色譜條件

檢測波長:285 nm;色譜柱：Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm);流動(dòng)相：A液∶乙腈;B液：0.04 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.5)[4]，A液∶B液=34∶66(體積比);過0.45 μm濾膜;等度洗脫;流速：1 mL·min-1;進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

用0.04 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.5)-乙腈(70∶30,體積比)的溶液，將泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋成10 mg·L-1、15 mg·L-1、20 mg·L-1的溶液，在270～295 nm范圍內(nèi)[5～7]，每隔5 nm測一次吸光度，結(jié)果見圖1。

圖1 不同波長下不同濃度泰樂菌素的吸光度值

由圖1可知，泰樂菌素在波長285 nm處有最大吸光度，因此本實(shí)驗(yàn)選擇泰樂菌素的檢測波長為285 nm。

2.2 樣品的前處理

經(jīng)測試，抗生素藥渣偏酸性，嘗試了以乙腈、甲醇為提取劑，乙腈效果最好，甲醇次之，從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，選擇甲醇為提取劑。

用藥渣生產(chǎn)的酵母培養(yǎng)物和飼用酶制劑的油脂含量高，由于甲醇和正己烷部分互溶，因此選擇索氏提取法，先用正己烷脫脂，再用甲醇提取。

2.3 方法的線性范圍、檢出限

方法的最小檢測限(以信噪比S/N=3計(jì))為0.31 mg·L-1，定量限(以信噪比S/N=10計(jì))為0.58 mg·L-1。在0.75～50 mg·L-1范圍內(nèi),其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=24195x-4782.4,相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，表明峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.4 回收率及精密度

稱取一定量的干麩皮，添加10 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-13個(gè)水平，每個(gè)樣品重復(fù)測試5次，結(jié)果見表1。

表1 泰樂菌素平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

由表1可知,平均回收率為47.25%～75.92%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.45%～8.53%(n=5)。

2.5 樣品的高效液相色譜圖及檢測結(jié)果

飼用酶制劑原料由泰樂菌素藥渣、麩皮等組成,在其中接入泰樂菌素降解菌和黑曲霉，經(jīng)一定時(shí)間發(fā)酵處理后，得飼用酶制劑。酵母培養(yǎng)物原料由泰樂菌素藥渣、玉米淀粉等組成，在其中接入泰樂菌素降解菌和酵母菌，經(jīng)一定時(shí)間發(fā)酵處理后，得酵母培養(yǎng)物。

按照1.3方法處理，測定了實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的酵母培養(yǎng)物和飼用酶制劑的泰樂菌素含量，結(jié)果見表2；其高效液相色譜圖見圖2。

表2 酵母培養(yǎng)物和飼用酶制劑的泰樂菌素殘留檢測結(jié)果

圖2飼用酶制劑原料(a)、飼用酶制劑(b)、酵母培養(yǎng)物原料(c)、酵母培養(yǎng)物(d)、泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品(e)的高效液相色譜圖

Fig.2HPLCchromatogramsoffeedenzymestuff(a),feedenzyme(b),yeastculturestuff(c),yeastculture(d),tylosinstandard(e)

由圖2可以看出，發(fā)酵前后泰樂菌素與其它化合物的分離度均很好，該方法適用于實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的酵母培養(yǎng)物和飼用酶制劑中泰樂菌素殘留的檢測。

3 結(jié)論

建立了酵母培養(yǎng)物和飼用酶制劑中殘留泰樂菌素的高效液相色譜檢測方法。泰樂菌素的檢出限為0.31 mg·L-1,在0.75～50 mg·L-1范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9993。在10 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1添加水平的回收率為47.25%～75.92%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.45%～8.53%。本實(shí)驗(yàn)為檢測用藥渣制得的飼用酶制劑及酵母培養(yǎng)物的泰樂菌素殘留提出了新方法，該方法簡便、高效、具有一定的參考價(jià)值，為抗生素藥渣的進(jìn)一步綜合治理和開發(fā)利用提供了依據(jù)。

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