甲氧芐啶對(duì)金銀花體外抗菌增效作用及量效關(guān)系的試驗(yàn)

崔一喆,王 新,韓鐵鎖

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,黑龍江大慶163319)

金銀花為常用傳統(tǒng)中藥,具有清熱解毒、抗多種病原微生物、免疫增強(qiáng)、消除耐藥質(zhì)粒等多種功效[1]。而甲氧芐啶(TMP)作為合成抗菌藥,本身抗菌作用較弱,一般不單獨(dú)應(yīng)用;臨床上TMP主要用作磺胺類(lèi)藥物的抗菌增效劑,其還可以增強(qiáng)多種抗生素類(lèi)藥物以及中草藥的抗菌作用[2-3]。但目前有關(guān)TMP對(duì)金銀花的抗菌增效作用研究較少,尤其增效的劑量關(guān)系研究未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)旨在通過(guò)研究金銀花與TMP聯(lián)用的性質(zhì)和增效的劑量關(guān)系,從而確定TMP對(duì)金銀花抗菌增效的最佳劑量,為中西藥復(fù)方制劑的開(kāi)發(fā)提供基本理論支持。

1 材料與方法

1.1 菌種 金黃色葡萄球菌、沙門(mén)菌和大腸桿菌分離株由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)教研室鑒定保存。

藥物:甲氧芐啶購(gòu)于太原市康瑞寶獸藥制造有限公司,批號(hào):20080503。金銀花購(gòu)于大慶福瑞邦醫(yī)藥有限公司,由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)中獸醫(yī)教研室林春驛教授鑒定。

1.2 藥物溶液的制備 精確稱(chēng)量128 mg的甲氧芐啶制成1 280 μ g/mL的甲氧芐啶藥液100 mL。采用水提醇沉法制備含2 g/mL生藥的金銀花提取液100 mL。將藥液流通蒸汽滅菌30 min,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌種活化 采用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)菌活化,將菌液稀釋至濃度為 1×107CFU/mL,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 金銀花與TMP聯(lián)用體外抗菌活性試驗(yàn) 采用微量棋盤(pán)稀釋法進(jìn)行試驗(yàn)。通過(guò)比濁法測(cè)定各藥和藥物聯(lián)合時(shí)的MIC值,參照徐淑云報(bào)道[4]的方法進(jìn)行FIC指數(shù)的計(jì)算和判定聯(lián)合應(yīng)用的性質(zhì)。

1.5 金銀花與TMP聯(lián)用體外抗菌量效關(guān)系試驗(yàn)采用試管二倍稀釋法及傾注平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行試驗(yàn)[5]。用無(wú)菌肉湯將金銀花提取液稀釋到2MIC濃度 ,將 TMP 稀 釋 到 640 μ g/mL 、320 μ g/mL 、160 μ g/mL、80 μ g/mL 和 40 μ g/mL 濃度 。取 7 只已編號(hào)無(wú)菌試管,1～5號(hào)管分別加入已稀釋的 4種TMP溶液1 mL和2 MIC的金銀花藥液1 mL,6號(hào)管中加入2 MIC的金銀花藥液和肉湯各1 mL,7號(hào)管為對(duì)照管加入肉湯2 mL;然后每個(gè)試管中加入2×106CFU/mL細(xì)菌懸液0.1 mL。充分搖勻后,4℃冰箱靜置。分別在 1、2、4、8 h傾注平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),計(jì)算殺菌率。其計(jì)算公式為:殺菌率=(對(duì)照管菌落數(shù)-試驗(yàn)管菌落數(shù))/對(duì)照管菌落數(shù)×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS軟件中ANOVA程序進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 金銀花與TMP聯(lián)用體外抗菌活性試驗(yàn) 由表1可知,金銀花與 TMP聯(lián)用對(duì)3種細(xì)菌的MIC值均小于單獨(dú)應(yīng)用,經(jīng)計(jì)算對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)菌FIC指數(shù)均在0.5～1之間,呈現(xiàn)相加作用。

表1 金銀花與TMP聯(lián)合應(yīng)用的抗菌效果

2.2 金銀花與TMP聯(lián)用體外抗菌量效關(guān)系試驗(yàn)

由表2可見(jiàn),隨著 TMP劑量的增加,金銀花與TMP聯(lián)用的抗金黃色葡萄球菌效果顯著增強(qiáng)。利用最小二乘法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,得到1、2、4 h和8 h殺菌率的回歸方程與擬合度分別為y=-0.000 5x2+0.244 4x+32.629,R2=0.970 7;y=-0.000 5x2+0.247 7x+48.486,R2=0.981 3;y=-0.000 4x2+0.196 7x+65.441,R2=0.950 2;y=-0.000 4x2+0.179 3x+77.064,R2=0.988 5。從而得出最優(yōu)值分別為 244 μ g · mL-1、248 μ g · mL-1、246 μ g ·mL-1和 224 μ g · mL-1,計(jì)算出 TMP 添加量的95%置信區(qū)間為 231 μ g ·mL-1～ 249 μ g ·mL-1。

表2 金銀花與不同濃度TMP聯(lián)用對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌率 (%)

由表3可知,隨著TMP劑量的增加,金銀花與TMP聯(lián)用的抗大腸桿菌效果顯著增強(qiáng)。利用最小二乘法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,得到1、2、4 h和8 h殺菌率的回歸方程與擬合度分別為y=-0.000 4x2+0.215 8x+32.301,R2=0.959 5;y=-0.000 4x2+0.192 6x+49.327,R2=0.973 6;y=-0.000 4x2+0.195 5x+59.158,R2=0.978 3;y=-0.000 4x2+0.190 0x+69.856,R2=0.979 8。從而得出 TMP最優(yōu)值分別為 270 μ g ·mL-1、241 μ g ·mL-1、244 μ g·mL-1和 238 μ g· mL-1,計(jì)算出 TMP 添加量的 95%置 信 區(qū)間 為 237 μ g ·mL-1～259 μ g ·mL-1。

表3 金銀花與不同濃度TMP聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大腸桿菌的殺菌率 (%)

由表4可知,隨著TMP劑量的增加,金銀花與TMP聯(lián)用的抗沙門(mén)菌效果顯著增強(qiáng)。利用最小二乘法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,得到1、2、4 h和 8 h殺菌率的回歸方程與擬合度分別為 y=-0.000 5x2+0.229 5x+32.999,R2=0.963 4;y=-0.000 5x2+0.240 0x+40.522,R2=0.981 7;y=-0.000 4x2+0.200 9x+51.288,R2=0.971 7;y=-0.000 3x2+0.160 5x+65.417,R2=0.992 3。從而得出 TMP最優(yōu)值分別為 230 μ g ·mL-1、240 μ g ·mL-1、251 μ g·mL-1和 268 μ g· mL-1,計(jì)算出 TMP 添加量的 95%置信區(qū)間為 235 μ g ·mL-1～ 259 μ g ·mL-1。

表4 金銀花與不同濃度TMP聯(lián)合應(yīng)用對(duì)沙門(mén)菌的殺菌率 (%)

3 討論

本試驗(yàn)采用了國(guó)內(nèi)外常用的微量棋盤(pán)稀釋法測(cè)定金銀花與TMP聯(lián)用的FIC指數(shù),試驗(yàn)結(jié)果表明TMP對(duì)金銀花發(fā)揮顯著的增效作用。這與周可炎等報(bào)道[6]TMP對(duì)金銀花有不同程度的抗菌增效作用相一致。金銀花抗菌機(jī)理與抑制細(xì)菌生物膜(biofilm,BF)的形成有關(guān),陳一強(qiáng)等[7]研究發(fā)現(xiàn)金銀花水煎液在體外能抑制銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,Pa)對(duì)固體表面的粘附能力及BF的形成能力,并能破壞Pa已形成的BF,增強(qiáng)抗生素頭孢他啶對(duì)BF內(nèi)銅綠假單胞菌的清除作用。TMP可抑制細(xì)菌核酸的合成,據(jù)此可推斷金銀花與TMP聯(lián)用時(shí)可抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖的各個(gè)階段而發(fā)揮抗菌作用。

FIC指數(shù)只能定性說(shuō)明藥物聯(lián)用的性質(zhì),而TMP最佳添加劑量更具有臨床應(yīng)用價(jià)值。因此在參照王芙蓉的試驗(yàn)方法[8]基礎(chǔ)上,為了避免 TMP發(fā)揮主要抗菌作用,選擇了稍高于MIC值的 TMP最大添加量;采用了4℃冰箱靜置的方式使藥物作用于細(xì)菌,避免了恒溫培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌呈幾何基數(shù)增殖造成的用藥組與對(duì)照組之間的不可比性;再通過(guò)對(duì)殺菌率進(jìn)行最小二乘法擬合,計(jì)算出 TMP增強(qiáng)金銀花抗3種細(xì)菌的最優(yōu)添加量的95%置信區(qū)間分別為 231 μ g · mL-1～ 249 μ g · mL-1、237 μ g ·mL-1～ 259 μ g · mL-1和 235 μ g ·mL-1～ 259 μ g·mL-1。徐永昭[9]經(jīng)研究中發(fā)現(xiàn)TMP對(duì)金銀花注射液有明顯的抗菌增效作用,其注射液中加入5%TMP抗菌增效作用最強(qiáng),故在臨床上可以配制含5%TMP的增效金銀花注射液。與本試驗(yàn)在定性研究中的TMP用量存在一定的差異,可能與試驗(yàn)方法和判定標(biāo)準(zhǔn)存在差異有關(guān)。

[1]王林青,崔保安,張紅英.金銀花藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2007,34(11):91-95.

[2]Ana C Gales,Ronald N Jones,So raya S Andrade.Antimicrobial susceptibility patterns of unusual nonfermentative gramnegative bacilli isolated from Latin America:report from the SENT RY Antimicrobial Surveillance Program(1997～2002)[J].Mem Inst Oswaldo,2005,100(6):671-677.

[3]陳杖榴.獸醫(yī)藥理學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2002:233.

[4]徐淑云,卞如濂,陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:1662-1663.

[5]馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2000:206-213.

[6]周可炎,曹迎春,譚超,等.TMP對(duì)中草藥煎液的抗菌增效作用[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,25(6):483-486.

[7]陳一強(qiáng),覃雪軍,朱蓮娜.金銀花水煎液及聯(lián)合頭孢他啶對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的體外影響[J].中華微生物學(xué)及免疫學(xué)雜志,2004,24(9):738-742.

[8]王芙蓉.TOHT復(fù)方制劑的抗菌、抗病毒及對(duì)免疫增強(qiáng)效果的研究[D].長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2006:21-24.

[9]徐永昭.TMP對(duì)金銀花注射液增效作用的研究[J].中成藥,1993,15(7):7-9.