新疆石河子地區犬細小病毒的分離鑒定與基因型分析

劉志強,張小鶯,黃 新,王光雷,努 爾,趙軍明,薄新文,王新華,鐘發剛

(1.新疆建設兵團綿羊繁育基因工程重點實驗室,新疆石河子832000;2.新疆畜牧科學院獸醫研究所,新疆烏魯木齊830000;3.德國柏林洪堡大學夏洛特醫學院藥理所,德國柏林10117)

犬細小病毒(canine parvovirus,CPV)是一種引起犬出血性腸炎或心肌炎的病毒[1]。歐洲首先在1976年和 1977年,在美國1978年都鑒定出存在CPV陽性血清.至1979年病例已蔓及世界各地[2-3]。1982年10月,我國報道在暴發傳染性出血性腹瀉的病犬糞便提取物中,發現細小病毒顆粒,其大小和形態結構具有典型的細小病毒特征,從而首次證實該病在我國的存在[4-5]。隨后,在我國各地陸續有本病發生的報道。近年來隨著城市寵物熱的興起,該病廣泛的傳播蔓延。據石河子市獸醫防疫站初步統計,在犬的各種傳染病中,犬細小病毒性腸炎發病率、死亡率均為最高,為當前犬的主要傳染病之一。本實驗室從病死犬的內臟中分離到1株犬細小病毒,初步命名為CPV-SHZ毒株。

1 材料與方法

1.1 病料及細胞 分別采集病死犬的心、肝、脾、小腸及內容物。CPV陽性血清(細小病毒疫苗免疫家兔制備)、F81貓腎傳代細胞(購自中國科學院上海生科院細胞資源中心)。紅細胞:采集健康豬抗凝的血液,洗滌后配成0.5%紅細胞懸液備用。

1.2 主要試劑 RPMI-1640完全培養基(Gibco公司),犢牛血清(蘭州民海生物工程有限公司),胰蛋白酶(Amresco),DNA Marker Gene Ruler 100bp DNA Ladder plus、PCR(上海生工生物工程技術服務有限公司),T aKaRa Ex Taq酶[寶生物工程(大連)有限公司]。PCR回收試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)。培養液為10%犢牛血清RPMI～1640,維持液為2%犢牛血清RPMI-1640,消化液為0.25%胰蛋白酶EDTA。

1.3 引物設計 根據已發表CPV的VP2基因序列利用Primer 5.0軟件設計了1對引物,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

上游引物(C1):5′-GGCAAGCT TATGAGTGATGGAGCAGTTC-3′

下游引物(C2):5′-CGCGTCGACTATGT TAATATAAT TT TCT-3′

1.4 病毒分離 采用同步接種法,同步接種F81貓腎細胞,24 h后將生長液棄去換上維持液,逐日觀察,待出現明顯的CPE(達80%)收毒,細胞長滿單層未出現CPE繼續傳代,整個過程設有對照。收獲病毒細胞培養物反復凍融3次,4 000 r/min離心30 min,上清液用氯仿處理2次,水相加入聚乙二醇-6 000(PEG),使其終濃度達 12%,4℃過夜,10 000 r/min離心30 min,沉淀用PBS稀釋,打碎沉淀塊,再次氯仿處理,水相即為病毒濃縮液。

1.5 病毒純化 病毒濃縮液用Sepharose-4B柱層析,用 0.01 moL/L PBS(pH值 7.2)平衡并洗脫[6-7],分管收集,用電鏡和SDS-PAGE電泳檢測洗脫液中的病毒。

1.6 病毒鑒定

1.6.1 HA及HI試驗 按文獻[8-9]方法進行。1.6.2 病毒毒力測定 F81細胞在96孔板上滴定病毒的TCID50。并用5-IUDR處理待鑒定病毒進行核酸型鑒定。

1.6.3 電鏡觀察 按文獻[1]方法進行。

1.6.4 VP2基因的擴增 取病毒濃縮液50 μ L隔水煮10 min后離心,上清即為模板。

PCR擴增體系:50 μ LPCR反應體系如下:(引物濃度 50 pmol/μ L),ddH2O(29.5 μ L),10 ×PCR Buffer(5 μ L),dNTP(8 μ L),模 板 (5 μ L),C1(1 μ L),C2(1 μ L),Taq 酶(0.5 μ L),PCR 反 應條件:95℃預變性5 min,94℃1 min,54℃1 min,72℃1.5 min,順序30個循環,72℃再延伸10 min。反應結束,取少量PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果,陽性產物-20℃保存備用。

1.6.5 VP2基因的序列分析 應用回收試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)回收PCR產物,將回收產物連接pMD18-T載體上轉化DH5α感受態細胞,37℃培養18～24 h,藍白斑篩選陽性菌接種于5 mL LB液體培養基(含100 μ g/mL Amp+),37℃培養過夜,分裝送上海生工生物工程技術服務有限責任公司進行測序。測序結果用序列分析軟件進行比較。

1.6.6 動物回歸試驗 選取兩月齡、未注射犬細小病毒疫苗易感犬5只,2只1組,分別皮下注射和口服途徑接種2 mL CPV細胞培養物,余下1只隔離飼養設為對照,攻毒3 d后,每日收集犬腸內容物作PCR檢測,逐日觀察各項生理指標。

2 結果

2.1 病毒分離結果 正常的F81細胞為貼壁生長、均質透明的不規則多邊形(見圖1)。接毒F81細胞,盲傳3～4代可見特征病變:脫落、變形、游離、拉網(見圖2)。

圖1 正常的F81細胞

2.2 病毒純化結果 病毒濃縮液經Sephrose-4B柱層析后,出現 2個洗脫峰,經 ELISA和 SDSPAGE電泳測定病毒抗原主要在第二峰,可見兩條清晰的條帶:76 ku的VP1,64 ku的VP2(見圖3),與文獻報道相[10]符合。免疫電鏡觀察結果(見圖4),可見病毒粒子呈圓形或六邊形,直徑為20～24 nm,多數為實心,少數為空心,表面無囊膜,病毒粒子呈聚集狀態。

2.3 病毒鑒定結果

2.3.1 HA和HI試驗結果 病毒培養物能凝集豬的紅細胞,其效價高于2×109,用已知CPV陽性血清可規律性的抑制其血凝作用。

2.3.2 PCR擴增結果 PCR擴增在1.7 kb處看到1條明亮的條帶,與所設計目的條帶大小相符合。2.3.3 病毒毒力測定結果 F81細胞測定CPVSHZ的TCID50為10-6.0,較加 5-IUDR處理(10-4.0)高3個對數。說明病毒代謝可被5-IUDR所抑制,其核酸類型屬于DNA型。

2.3.4 序列分析結果 將測定核酸序列及推導的氨基酸序列與 CPV參考株 V154、LCPV-V204、LCPV-V139、LCPV-V203進行比較分析。從結果可看出此次分離到的CPV為2a型。但是其VP2的第970、971、1 694位氨基酸分別發生了A→T、T→A、G→A的替換。其第424位和564位氨基酸發生I→V和S→N的替換。

2.4 動物回歸試驗 兩種途徑接種試驗動物犬,分別在第3天和第5天出現體溫升高、厭食、精神沉郁、灰白色粥狀樣糞便等臨床癥狀。病犬白細胞數減少到6 400個/mm3(未接種前試驗犬的白細胞數為12 000～13 000個/mm3)左右。發病后7 d死亡,剖檢可見尸體消瘦,嚴重脫水,皮膚干燥,有碎屑。可視黏膜蒼白,眼球凹陷;胃內空虛,胃底部黏膜出血;空腸及回腸黏膜充血,腸腔擴張;腸內容物水樣暗紅色,有特殊的臭味,腸系膜淋巴結腫脹,腸絨毛明顯萎縮,黏膜脫落。

3 討論

3.1 病毒分離 用F81貓腎傳代細胞增殖CPV出現了明顯的CPE,這與前人的研究結果[11]相符合。為提高病毒的分離率,在糞便處理時可使用氯仿抽提,并按細胞培養液的1/20進行接種。由于CPV的DNA在復制時需要處于有絲分裂過程中宿主細胞某些機能的輔助[12],采取細胞培養同步接種病毒,能達到使病毒良好增殖的目的。

3.2 病毒鑒定 HA檢測結果與犬細小病毒特性相符,并且能被CPV陽性血清規律性抑制,在日常應用中能經濟、簡便、快捷、可靠的對CPV作出鑒定;免疫電鏡觀察到大小均一、成聚集狀態的病毒粒子,從形態上對CPV作以鑒定;根據犬細小病毒的基因組設計特異性寡核苷酸引物進行PCR擴增,經瓊脂糖凝膠電泳檢測到相應的目的條帶。測序得到犬細小病毒VP2全基因組序列。序列比較分析,與CPV參考株同源性在99%以上。在分子水平上對CPV作以鑒定。

3.3 病毒純化 用Sephrose-4B柱層析純化CPV,具有操作簡單、快速的特點,可以處理大量的病毒細胞培養物,純化的病毒可用作制備診斷抗原和疫苗。3.4 序列比對分析 1978年CPV被發現至今,先后出現了 5個突變株亞型,即 CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c(a)、CPV-2c(b)[13]。Parrish C R等[14]在研究CPV的進化時發現,CPV-2a是在1981年取代了自 1978年以來的CPV-2型,而CPV-2b抗原類型在1986年發現。CPV-2到CPV-2a、CPV-2b,只有幾個堿基發生了變異,抗原則發生變異。CPV-2a(2b)VP2的87位、300位氨基酸和305位氨基酸與 CPV-2不同。CPV-2a和CPV-2b只有426位氨基酸不同,426D是CPV-2b特有的[15]。在CPV-2a和CPV-2b的VP2的第300位氨基酸發生G到D替換,分別命名為 CPV-2c(a)和 CPV-2c(b)[16]。本試驗克隆了CPV-VP2基因的1 755 bp,從起始密碼子到1 755 bp處,參照分型標準應為CPV-2a型,這與文獻報道目前在我國流行的毒株以CPV-2a占主要地位相符合,這與CPV在意大利、澳大利亞和英國的流行情況相似。分離株在324、424位氨基酸與564位氨基酸突變,這種變異還未見文獻報道,該位氨基酸變化是否引起生物學特性改變還有待進一步研究。

本試驗通過新疆石河子分離株(CPV-SHZ)VP2基因的序列分析,為我國CPV分子流行病學調查提供了一定的參考依據,并為進一步探討CPV的抗原變異及研制CPV基因工程疫苗奠定了基礎。

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