新型水蛭肽嵌合蛋白治療腦出血后腦水腫的實驗研究

楊 輝，周遠大，何海霞

（1.重慶醫科大學附屬第一醫院藥劑科，重慶 400016； 2.重慶醫科大學附屬第一醫院臨床藥理教研室，重慶 400016）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）的發病率、病死率、致殘率均較高，嚴重威脅人類健康和生命[1]。原發性腦出血時，出血后血腫的占位效應及分解產物會導致周圍腦組織腦血流下降、繼發性腦水腫、顱內壓增高等連鎖反應，使病情惡化。水蛭肽嵌合蛋白（TNHH）是采用基因工程技術構建的雙功能嵌合蛋白，由重組中性粒細胞抑制因子（neutrophil inhibltory factor）、纖維蛋白的結合肽和水蛭素活性肽段嵌合，具有中性粒細胞抑制因子的功能和凝血酶的活性，由重慶富進生物醫藥公司采用大腸桿菌表達系統制備而成。TNHH對大鼠動脈阻塞性腦缺血損傷有明顯的保護作用[2]。本試驗采用TNHH對腦出血大鼠進行治療，觀察腦出血后大鼠腦含水量、神經功能損傷與髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）之間的關系以及TNHH治療的效果，探討其治療作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：健康合格清潔級SD大鼠96只，雄性，體重180～230 g，由重慶醫科大學試驗動物中心提供。

儀器：動物立體定位儀（上海第二軍醫大學）；BP61型電子分析天平（德國Sartorius）；VXH-3型微型漩渦混合器（上海躍進醫療器械廠）；低溫醫用冰箱（日本SANYO）；Uvimini-1240型紫外分光光度計（日本SHIMADZU）；微量注射器（寧波市三愛儀器廠）；紅外恒溫干燥箱（上海躍進器械廠）。

主要試劑與藥品：注射用TNHH，由重慶富進生物醫藥公司提供，系凍干制劑，規格為 3 mg/支，純度大于 95%，批號為20050401；部分凝血活酶活性時間（APTT）試劑盒，購自上海太陽生物技術公司；MPO測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥

將96只大鼠隨機分為假手術組（A組）、腦出血模型組（B組）、TNHH組（C組），每組32只，A組只進針不注血。A組和B組靜脈注射等容量生理鹽水，C組靜脈注射TNHH 2 mg/kg。分別于造模前30 min及造模后每12 h給藥1次，于6，24，72，168 h時分別用Longa標準[3]測定神經功能缺損。各組大鼠在處死前進行神經功能缺損評分，0級為無體征，記0分；Ⅰ級為動物不能完全伸直其前肢，記1分；Ⅱ級為動物一側肢體癱瘓，有追尾現象，記2分；Ⅲ級為動物不能站立、打滾，記3分；Ⅳ級為無自發性活動，有意識障礙，記4分。評分在1～4分之間且取腦時可見腦內血腫形成的大鼠入選實驗組，表明腦出血模型制作成功。

1.2.2 模型制備

參照改良的自體尾動脈血兩次注血法制作腦出血模型[4]。術后用醫用骨蠟封閉骨孔，縫合頭部皮膚，整個過程采用無菌操作。大鼠清醒后無偏癱體征（Longa評分）或血液沿針道反流者棄用。A組操作與制作模型步驟相同，但不注血。

1.2.3 測定指標及方法

腦含水量（干濕重法）：各時間點每組動物處死后迅速取出全腦，置冰臺上，去除小腦和腦干。從進針點將大腦冠狀位切成前后兩部分，前部腦組織留做HE染色，后部腦組織再從矢狀縫切開成左右兩半，分別稱其濕重后，置100℃恒溫干燥箱24 h后稱其干重。腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

MPO：各組大鼠分別于不同時相點斷頭取腦，用4℃的冰鹽水沖洗干凈腦表面的血液，后用濾紙吸干凈，以進針點作冠狀切面，取血腫周圍新鮮腦組織200 mg，按照1∶9的比例加入磷酸鹽緩沖液（PBS），冰浴下勻漿，4℃ 條件下3 000 r/min離心15 min后，取上清液，即為待檢樣品。測定MPO活性，具體操作按試劑盒說明書進行。

APTT：在不同時相點Longa評分后，經頸動脈取血1.8 mL，迅速加入盛有0.2 mL的0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝液的硅化玻璃管中，輕輕顛倒混勻，3 000 r/min離心15 min，收集上層液體，測定APTT，以判斷TNHH對凝血功能的影響。

HE染色：將腦水腫測量剩余的進針點前部腦組織用甲醛固定后石蠟包埋，切取片厚5 mm，常規HE染色，觀察水腫細胞形態及炎癥細胞浸潤等情況。

1.2.4 統計學處理

采用SPSS統計軟件包進行數據分析，各組數據以均數±標準差表示，兩兩比較用 t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

HE染色：光學顯微鏡下觀察，A組大鼠大腦各部分細胞排列整齊，形態結構完整，基質無水腫，無炎性細胞浸潤；B組血腫周圍神經元數目明顯減少，排列紊亂，基質水腫明顯，細胞形態不完整，有大量炎性細胞及肥大變形的膠質細胞浸潤；C組與同時相點B組比較，血腫周圍水腫帶及炎癥細胞浸潤等均有不同程度的改善。

神經功能缺損評分：結果見表1。B組大鼠神經功能缺損在24 h時最明顯，各個時相點顯著高于A組；C組大鼠各個時相點神經功能缺損均顯著低于B組，但仍高于A組。

腦含水量：結果見表1。B組大鼠腦含水量從6 h開始逐漸增多，72 h達高峰，與A組大鼠相比有顯著性差異，168 h時差異則不顯著；C組大鼠從6～72 h腦含水量與B組相比均顯著下降，168 h時差異則不顯著（P＞0.05），與A組比較無顯著性差異。

表1 各組大鼠不同時間觀察指標比較（±s）

表1 各組大鼠不同時間觀察指標比較（±s）

注：與 A 組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01；與 B組比較，□P＜0.05，■P＜0.01。

時間（h）神經功能缺損評分（分） 腦含水量（%） 腦勻漿MPO（MPO單位/g濕片） 血清APTT（s）A組B組B組C組C組A組B組C組A組B組C組6 24 72 168 A組 0 0 0 0 1.750±0.707 2.750±0.707 2.375±6.744 1.375±0.518 1.125±0.354□1.625±0.744■1.652±0.518□0.875±0.354□76.72±0.73■76.68±0.64■78.85±0.82■73.32±1.79 78.83±1.08▲79.78±1.30▲79.14±1.76▲77.72±2.02 77.57 ±0.85△□77.80±2.15△77.74±0.64△76.52±0.88 0.049±0.011□0.049±0.011■0.049±0.011■0.049±0.011 0.083±0.021△0.086±0.015▲0.089±0.007▲0.065±0.013 0.050±0.012□0.054±0.011■0.054±0.011■0.051±0.015 20.71±2.75□19.71±2.75■19.71±2.75■19.71±2.75 18.00±1.15△17.00±1.29▲16.29±1.51▲20.14±2.79 19.86±3.13 19.43±2.88 19.29±2.87□19.86±3.13

腦勻漿MPO：結果見表1。B組大鼠腦勻漿MPO從6 h開始逐漸增多，72 h達高峰，與A組大鼠相比有顯著性差異，168 h時差異則不顯著；C組大鼠從6～72 h腦勻漿MPO與B組相比均顯著下降，168 h時差異則不顯著，與A組比較無顯著性差異。

血清APTT：結果見表1。B組大鼠血清APTT值從6 h開始逐漸縮短，72 h時最明顯，與A組大鼠相比有顯著性差異，168 h時差異則不顯著；C組大鼠血清APTT測定僅在72 h時與B組相比有顯著性差異，其余各觀察時間點與B組、A相比差異均不顯著。

3 討論

對于腦出血，目前臨床尚缺乏有效的防治手段，因此對出血性腦損傷的病理生理機制研究顯得尤為重要。本研究參照改良的自體尾動脈血兩次注血法制作腦出血模型[4]，術后腦出血模型組大鼠均出現神經功能缺損體征，腦含水量明顯增加，表明大鼠腦出血模型是成功的。

既往研究表明[5]，出血后腦損傷有多種機制，如凝血酶的毒性、血腫周圍水腫帶及炎癥細胞浸潤、血腫分解產物、繼發性顱內高壓等，其中前兩者尤為重要。凝血酶作為一種細胞外信號分子，介導神經毒性作用是通過其受體實現的[6]。急性腦出血后血液凝固過程中可釋放大量凝血酶，直接滲透或緩慢釋放到組織間隙，作用于局部神經膠質細胞、神經元和血管內皮細胞膜上凝血酶受體，促進細胞內信號轉導，誘導多種炎性細胞因子的表達，而這些炎性細胞因子促進白細胞黏附于血管內皮細胞或神經細胞，從而加重炎性損傷。

中性粒細胞抑制因子可減少血腫周圍水腫帶中性粒細胞的積聚、滲出，減輕中性粒細胞介導的炎性反應和減少微血栓的形成，防止液體從血腦屏障滲出，從而有效減輕腦水腫，減輕神經功能的損害[7]。水蛭素是凝血酶特異抑制劑，可直接減輕凝血酶的神經毒性。本研究顯示，TNHH可明顯改善腦出血大鼠神經功能缺損體征，減輕腦出血后腦含水量和病理損害，降低急性腦出血后血腫周圍組織白細胞特征性成分MPO的活性，與腦出血模型組相比有顯著性差異（P＜0.01或 P＜0.05）。可見，TNHH能明顯減輕腦出血后腦水腫，值得進一步開發。

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