不同方法除鞣質(zhì)后貫葉金絲桃提取物中金絲桃素的含量變化*

李前瓊 ，王金林 ，王曉利 ，張俊松 ，張德志

（1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518055； 2.廣東藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

貫葉金絲桃 Hypericum performatum L.又名貫葉連翹、圣約翰草，為藤黃科金絲桃屬植物，具有清熱解毒、抗菌消炎、消腫止血、利濕止痛等功效[1]。研究證明，貫葉金絲桃主要活性成分金絲桃素（hypericin，HY）具有抗抑郁、抗病毒、抗腫瘤等作用[2-4]。在醫(yī)藥工業(yè)和臨床上目前應(yīng)用的主要是貫葉金絲桃的提取物，但其中還含有鞣質(zhì)、有機(jī)酸、揮發(fā)油等雜質(zhì)成分，其中鞣質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)10%[5]。鞣質(zhì)又稱單寧或植物單寧，是一類廣泛存在于植物體內(nèi)且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多元酚化合物，可溶于水、乙醇、丙酮等，高含量的鞣質(zhì)會(huì)對(duì)后續(xù)分離純化HY帶來(lái)困難。本試驗(yàn)考察了不同方法除去貫葉金絲桃提取物中的鞣質(zhì)，并利用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定除鞣質(zhì)后HY含量的變化和收率。

1 儀器與試藥

島津LC-20A高效液相色譜儀，包括SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器，LC-20AT輸液?jiǎn)卧珻BM-20Alite系統(tǒng)控制器，島津LC-20A配套處理軟件LC-solution；KQ2200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorious萬(wàn)分之一電子天平。金絲桃素對(duì)照品（瑞士Alexis Biochemicals公司，純度為99.2%，批號(hào)為L(zhǎng)15535/a）；貫葉金絲桃提取物（常州神馬植物提取有限公司）；明膠（廣東環(huán)凱生物科技有限公司）；甲醇為色譜純（天津協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司）；乙醇為分析純（臺(tái)山市粵僑試劑塑料有限公司）；水為超純水；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HY含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件[6]

色譜柱：Phenomenex-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.006 mol/L Na2HPO4（7∶1，V/V，H3PO4調(diào)pH=6.5）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：590 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 溶液制備

精密稱取貫葉金絲桃提取物0.5 g，置10 mL棕色量瓶中，以色譜純甲醇超聲溶解后定容，作為供試品溶液。精密稱取金絲桃素對(duì)照品0.97 mg，置5 mL棕色量瓶中，色譜純甲醇超聲溶解后定容，精密吸取1 mL，置10 mL棕色量瓶中定容，配制成質(zhì)量濃度為0.019 4 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密吸取對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1，5，10，15，20，25 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積對(duì)HY進(jìn)樣量作線性回歸，回歸方程為 Y=2 722 400.781X-6 184.994，r=0.999 9（n=6）。結(jié)果表明 HY進(jìn)樣量在0.019 4～0.776 0 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。結(jié)果峰面積的 RSD為0.041%（n=5），表明方法精密度良好。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：分別精密稱取同一批次樣品0.5 g，依法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果HY的平均含量為0.088%，RSD為0.067%（n=6），表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，于 0，2.5，5.0，7.5，10 h 時(shí)依法測(cè)定。結(jié)果的 RSD為0.16%（n=5），表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液5份，各500 μL，分別精密加入0.019 4 mg/mL的對(duì)照品溶液500 μL，混勻后依法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 HY加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 （n=5）

2.2 未除鞣質(zhì)提取液制備

精密稱取貫葉金絲桃提取物2 g，置具塞錐形瓶中，加入60%乙醇20 mL，密塞后超聲處理40 min，取出冷卻至室溫，過(guò)濾，濾液定容于50 mL量瓶中，0.45 μm濾膜過(guò)濾，以HPLC法測(cè)定HY含量，計(jì)算出貫葉金絲桃提取物中HY含量。

2.3 不同方法除鞣質(zhì)提取液制備

明膠沉淀法：精密稱取貫葉金絲桃提取物2 g，置具塞錐形瓶中，加入60%乙醇20 mL，密塞后超聲處理40 min，取出冷卻至室溫。加入10%明膠溶液5 mL（慢加快搖），靜置片刻后濾去沉淀，調(diào)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)至75%以除去過(guò)量明膠，過(guò)濾，濾液定容于50 mL量瓶中，0.45 μm 濾膜過(guò)濾，HPLC法測(cè)除鞣質(zhì)提取液中HY含量。減壓揮去溶劑后，測(cè)定除鞣質(zhì)后貫葉金絲桃提取物固形物質(zhì)量，計(jì)算HY的含量和收率。

改良明膠沉淀法：加入10%明膠溶液5 mL（慢加快搖）前的操作同明膠沉淀法，靜置片刻，調(diào)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)至75%，4℃冷藏過(guò)夜，過(guò)濾，濾液定容于50 mL量瓶中，后續(xù)操作同明膠沉淀法。

堿性醇沉法：密塞后超聲處理40 min前的操作同明膠沉淀法，取出冷卻至室溫，調(diào)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)至80%后，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH=8，4℃冷藏過(guò)夜，過(guò)濾，濾液定容于50 mL容量瓶中，后續(xù)操作同明膠沉淀法。

2.4 除鞣效果檢測(cè)

分別取2.3項(xiàng)下各除鞣液1 mL，滴加10%明膠溶液1 mL，根據(jù)藥液渾濁程度檢驗(yàn)除鞣效果。結(jié)果明膠沉淀法和改良明膠沉淀法能完全去除鞣質(zhì)，在除鞣提取液中滴加明膠溶液未出現(xiàn)混濁，溶液澄明；而堿性醇沉法除鞣液加明膠溶液后則出現(xiàn)少許混濁，說(shuō)明除鞣不完全。

2.5 樣品含量和收率測(cè)定

分別取貫葉金絲桃提取物除鞣前后的樣品液，在2.1.1項(xiàng)下色譜條件下測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算HY含量和收率，結(jié)果見(jiàn)表2。可見(jiàn)明膠沉淀法除鞣質(zhì)后提取物固形物質(zhì)量降低較多，雖除鞣完全，但除鞣后HY損失較大，收率較低；堿性醇沉法除鞣質(zhì)，HY收率雖較高，但除鞣不完全；改良明膠沉淀法除鞣質(zhì)HY損失較少，純度有所提高，且鞣質(zhì)去除完全，可以有效減少后續(xù)分離純化色譜填料對(duì)鞣質(zhì)的死吸附，有利于填料再生，減少?gòu)U料產(chǎn)生和環(huán)境污染。

表2 3種方法HY含量變化和收率比較（n=3）

3 討論

獲得高純度的HY是當(dāng)前世界植物藥市場(chǎng)的研究熱點(diǎn)之一，但貫葉金絲桃中大量存在的鞣質(zhì)，為后續(xù)分離純化帶來(lái)困難。不同方法除鞣質(zhì)后對(duì)貫葉金絲桃提取物中活性成分HY含量和收率的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)建立了改良明膠沉淀除鞣法，其HY含量和收率較高，且簡(jiǎn)便易行、重現(xiàn)性好，可供植物活性成分純化工藝的研究和改進(jìn)參考。

[1]李 艷，曹學(xué)麗，付 鵬，等.貫葉金絲桃活性成分及其分離純化與檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)進(jìn)展，2008，32（1）：15.

[2]胡 然，庫(kù)寶善，張永鶴.人類免疫缺陷病毒與皰疹病毒感染具有相關(guān)性[J]. 生理科學(xué)進(jìn)展，2004，35（1）：63-65.

[3]楊得坡，甘良春，胡海燕.國(guó)外對(duì)貫葉連翹抗抑郁療效的臨床驗(yàn)證[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2004，2（3）：231-238.

[4]施正福，范 焱.貫葉金絲桃的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2000，17（3）：190-193.

[5]李 瑩，禹玉洪，楊書(shū)良，等.貫葉連翹的提取與除鞣工藝研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22（2）：13.

[6]張俊松，王曉利，羅 謙，等.不同產(chǎn)地貫葉金絲桃中金絲桃素和偽金絲桃素的含量分析[J].中國(guó)藥業(yè)，2006，15（12）：11.