硫磷鐵法測定大豆甾醇提取物中總甾醇含量

徐小軍，余國珍，陳鑒東

（浙江京新藥業股份有限公司，浙江 新昌 312500）

大豆甾醇提取物為豆科植物大豆 Glycine max（L.）Merr.果實在生產大豆油過程中的副產物——脫臭餾出物經提取純化所得的甾醇類化合物，主要含有β-谷甾醇、豆甾醇及菜油甾醇等多種活性植物甾醇，具有調血脂、抗炎、抗腫瘤、調節免疫等多種生理功能[1]。文獻報道的總甾醇含量測定方法有重量法[2]、分光光度法等，前者已較少被采用，分光光度法中有采用醋酐-濃硫酸顯色法（Lieberman-Burchard反應原理）[3]及香草醛-冰醋酸、高氯酸比色法[4]，但此兩方法因干擾成分及影響因素較多，試劑的用量、反應時溫度以及反應后放置時間等因素影響較明顯，測定結果往往比實際偏高且重現性較差。筆者參考有關文獻，將測定血清膽甾醇常用方法硫磷鐵顯色法[5-6]用于大豆總甾醇含量測定。硫磷鐵法的原理是甾醇在濃硫酸及三價鐵的作用下形成比較穩定的紫紅色化合物，其在520～550 nm波長處有特征吸收峰，且質量濃度與吸光度呈正比關系。現報道如下。

1 儀器與試藥

TU-1800型、TU-1900型分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。大豆甾醇（批號為 20081101，20081102，20081103，浙江京新藥業股份有限公司）；β-谷甾醇對照品（批號為110851-200605，含量為98.0%，中國藥品生物制品檢定所）；濃磷酸、濃硫酸及三氯化鐵均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

取60℃減壓干燥至恒重的β-谷甾醇對照品約2.5 mg，精密稱定，加無水乙醇溶解并定容至25 mL，即得對照品溶液。取樣品約70 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，精密移取5.0 mL稀釋并定容至50.0 mL，搖勻，即得供試品溶液。稱取三氯化鐵（FeCl3·6H2O）2.5 g，溶于87%濃磷酸內，并定容至100 mL，得鐵貯存液，此液可長期保存。取鐵貯存液8.0 mL，加濃硫酸至100 mL，即得磷硫鐵顯色劑。精密移取5.0 mL對照品或供試品溶液，置10 mL具塞刻度試管中，再沿管壁緩慢地向各試管中加入5.0 mL磷硫鐵顯色劑，搖勻，室溫下冷卻30 min，即得對照品或供試品的顯色溶液，以無水乙醇同法作空白。

2.2 檢測波長選擇

精密移取5.0 mL對照品溶液及供試品溶液，以無水乙醇為空白參比，分別按2.1項下方法制得顯色溶液，于750～350 nm波長范圍內掃描。結果對照品溶液與供試品溶液在530 nm波長處具有相同的最大吸收峰，故選擇530 nm為測定波長（圖 1）。

圖1 紫外光譜圖

2.3 顯色劑用量確定

精密移取5.0mL供試品溶液，分別用1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL磷硫鐵顯色劑，用濃硫酸補足至10.0 mL，搖勻，室溫下冷卻30 min，于530 nm波長處測定吸光度。結果對應的吸光度分別為0.175，0.397，0.594，0.650，0.653。可見，顯色劑用量達到 4.0 mL 后吸光度達最大并趨于穩定，為移液及計算方便，確定顯色劑用量為5.0 mL，定容為10.0 mL的體系。

2.4 方法學考察

線性關系考察：精密移取 0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL β - 谷甾醇對照品溶液，置10 mL具塞刻度試管中，各加入無水乙醇5.0，4.0，3.0，2.0，1.0，0 mL，分別按 2.1 項下方法制得對照品顯色溶液，照分光光度法[2005年版《中國藥典（一部）》附錄ⅤB]在530 nm波長處測定吸光度，以吸光度（Y）對β-谷甾醇質量濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程為 Y=13.586 X+0.021 4，r=0.999 6（n=6）。結果表明β-谷甾醇質量濃度在10.29～51.45 μg/mL范圍內與吸光度線性關系良好。

精密度試驗：精密移取對照品溶液5.0 mL，按2.1項下方法制得對照品顯色溶液，測定吸光度。結果 RSD為1.3%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密移取供試品溶液5.0 mL，加入5.0 mL磷硫鐵顯色劑顯色后，分別于 0，30，60，90，120，150，180 min 時測定吸光度。結果 RSD為0.6%（n=7），表明供試品溶液在3 h內穩定。

重現性試驗：精密稱取同一批樣品（批號為20081101），依法測定。結果總甾醇的平均含量為97.17%，RSD=1.6%（n=6），表明方法重現性良好。

加樣回收試驗：取已知總甾醇含量的樣品（批號為20081101）約3.5 mg，精密稱定，分別精密移入已知含量的對照品溶液（356.20 μg/mL）5，5，10，10，15，15 mL，溶解至 100 mL，依法測定含量，計算回收率。結果見表1。

表1 總甾醇加樣回收試驗結果（n=6）

2.5 樣品含量測定

取3批樣品，按2.1項下方法制得供試品顯色溶液，于530 nm波長處依法測定，計算總甾醇含量。結果批號分別為20081101，20081102，20081103的含量分別為98.2%，98.6%，97.5%。

3 討論

磷硫鐵顯色劑最好是新鮮配置的，否則會影響顯色程度，但鐵貯存液可長期保存。穩定性試驗表明，顯色反應快且3 h內顯色穩定，但對照品溶液或供試品溶液與磷硫鐵顯色劑混合時會放出大量熱，使溶液溫度明顯升高，故應冷卻30 min至室溫后，再測定吸收度。

方法學考察結果表明，本測定方法重現性良好，操作簡便，對照品用量少（β-谷甾醇對照品價格昂貴），檢測成本低，為大豆總甾醇的含量測定建立了一種快速而經濟有效的方法。

[1]韓軍花.植物甾醇的性質、功能及應用[J].國外醫學·衛生學分冊，2001，28（5）：285-291.

[2]胡于魯，劉銀燕.重量法測定大豆甾醇的含量[J].白求恩醫科大學學報，1995，21（1）：99-100.

[3]李英霞，王風云.可見分光光度法測定大豆甾醇提取物中總甾醇的含量[J]. 遼寧中醫藥大學學報，2007，9（5）：154-155.

[4]魏璐雪.中藥制劑分析[M].上海：上海科學技術出版社，1997：185-186.

[5]王繼貴，粟春輝，袁大偉，等.臨床生化檢驗[M].長沙:湖南科學技術出版社，1981：205-206，370.

[6]楊昌國.血清高密度脂蛋白膽固醇微量測定法[J].中華醫學檢驗雜志，1979，2（2）：85.