高效液相色譜法測定活血鎮痛膠囊中阿魏酸含量

陳 福

（浙江省舟山市人民醫院，浙江 舟山 316000）

活血鎮痛膠囊是舟山市中醫骨傷聯合醫院根據老中醫經驗方自制的制劑，主要由當歸、丹參、赤芍、三七、土鱉蟲等10味中藥組方，具有活血祛瘀、行氣鎮痛等功效，臨床用于治療跌打損傷、氣滯血瘀等各種痛證。該制劑目前尚無質量標準，為了保證藥品質量，筆者參考有關文獻[1-2]，采用高效液相色譜（HPLC）法測定了方中當歸的阿魏酸含量。現報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 Series高效液相色譜系統，包括G1311A四元泵、G1329A自動進樣器、DAD檢測器；USC-502型超聲處理器（上海波龍電子設備有限公司）。阿魏酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為0773-9910，含量測定用）；乙腈為色譜純；水為重蒸餾水；其他試劑均為分析純；活血鎮痛合劑（舟山市中醫骨傷聯合醫院制劑室，批號為 20090305，20090501，20091001）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：DiamonsilTMC18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -乙腈 -1%冰醋酸（20∶10∶70）；檢測波長：320 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在此色譜條件下，阿魏酸與其他組分完全分離，分離度大于1.5，理論塔板數以阿魏酸計不低于3 000。

2.2 溶液制備

精密稱取經五氧化二磷減壓干燥12 h的阿魏酸對照品19.20 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液；精密量取此貯備液1 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成質量濃度為15.36 μg/mL的對照品溶液。取樣品約1 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入70%的甲醇50 mL，超聲30 min，過濾，棄去初濾液，取續濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。按處方比例和制法制成缺當歸的陰性樣品，取陰性樣品約1 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

陰性干擾試驗：取2.2項下3種溶液，在上述色譜條件下分別進樣，色譜圖見圖1。可見，供試品溶液中阿魏酸色譜峰與其他組分峰完全分離，陰性對照品溶液對阿魏酸的測定無干擾。

線性關系考察：精密吸取對照品貯備液0.1，0.4，0.8，1.6，2.0，3.2 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。分別按擬訂的色譜條件測定，以峰面積為縱坐標（Y）、對照品質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，得回歸方程 Y=83.931 X-19.585，r=0.999 8（n=6）。結果表明阿魏酸質量濃度在 3.84 ～122.88 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

精密度試驗：取同一對照品溶液，依法重復進樣6次。結果阿魏酸峰面積的 RSD為0.6%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，按擬訂的色譜條件于24 h內每隔一定時間進樣測定。結果峰面積的 RSD為0.8%（n=6），表明供試品溶液在室溫下至少24 h內穩定。

重現性試驗：取同一批（批號為20090501）樣品5份，依法測定。結果阿魏酸含量分別為 99.46，100.54，101.08，97.57，98.65 μg/g，平均99.46 μg/g，RSD為1.4%（n=5），表明方法重現性良好。

加樣回收試驗：精密稱取已知含量的樣品（批號為080603）6份，分別精密加入阿魏酸對照品適量，依法測定含量并計算回收率。結果見表1。

2.4 樣品含量測定

分別吸取對照品溶液及供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，外標一點法計算含量。結果見表2。

3 討論

關于HPLC法測定阿魏酸含量的報道較多[1-4]，一般多采用不同濃度的甲醇或乙醇作為提取溶劑。本試驗曾分別用乙醇、50%甲醇和70%甲醇作溶劑提取，結果用乙醇和50%甲醇提取溶液顏色較深，雜質峰較多，色譜峰分離不理想，且供試品對色譜柱損害較大；用70%甲醇提取所得溶液雜質峰較少，阿魏酸較穩定，故選用70%甲醇作為提取溶劑。曾比較了用70%甲醇水浴回流30 min和用70%甲醇超聲30 min，結果發現，這兩種提取方式對阿魏酸峰面積沒有影響，但回流方式較煩瑣，且回流中裝置不容易洗干凈，故選用超聲方式。進一步分別采用超聲30，60，90 min不同時間提取樣品，結果表明超聲30 min時阿魏酸能提取完全，為了節省試驗時間，故選用超聲30 min。

表1 阿魏酸加樣回收試驗結果（n=6）

表2 樣品含量測定結果

為了得到較理想的色譜峰，根據阿魏酸的性質用不同廠家、不同型號的色譜柱進行了比較，結果用Agilent Extend C18柱和Agilent Zorbax SB C18柱時阿魏酸峰前拖尾較嚴重，柱效不高；用Hypersil ODS柱阿魏酸峰的出峰時間較長；DiamonsilTMC18柱既能達到很高的柱效，又可使雜質峰得到較好分離，且出峰時間合適。

[1]黃東萍，文東旭，林文翰.HPLC法測定川芎及天芎注射液中阿魏酸的含量[J]. 中草藥，2004，35（4）：409-411.

[2]王瑞明，蘇 強，倪 艷，等.HPLC法測定安腦痛中阿魏酸的含量[J].中成藥，2003，20（2）：164-165.

[3]閽雪梅，趙慧萍，嚴色紅.HPLC法測定通脈顆粒中阿魏酸的含量[J].中草藥，2003，34（2）：230-231.

[4]閔凡新，李文玉，王彥為，等.HPLC法測定當歸中阿魏酸的含量[J].中草藥，2004，35（3）：332-333.