兩種規格奧硝唑膠囊微生物限度檢查方法探討

由亞寧，彭 霞

(1.陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安 710061;2.甘肅省醫藥學校，甘肅 蘭州 730020)

奧硝唑膠囊為化學制劑，主要成分即奧硝唑，臨床上主要用于厭氧菌感染引起的多種疾病[1]。為了更有效地控制藥品內在質量，筆者根據用藥途徑和處方，采用消除其抗菌活性的方法，對其可能污染的微生物進行有效檢測。現按照2005年版《中國藥典(二部)》附錄ⅪJ微生物限度檢查法有關規定[2]，將試驗菌分別加入兩種規格的奧硝唑膠囊中，并對各試驗菌的回收率進行驗證，建立了奧硝唑膠囊的微生物限度檢查方法[3]，報道如下。

1 儀器與試藥

HTY－2000型集菌儀(杭州市泰林醫療器械廠);生化培養箱。試驗菌包括枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]，金黃色葡萄球菌[CMCC(B)63501]，大腸埃希菌[CMCC(B044102)]，白色念珠菌[CMCC(F)98001]，黑曲霉[CMCC(F)98003]，所用菌種均為第2代。營養肉湯培養基、改良馬丁培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、營養瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、膽鹽乳糖發酵培養基、麥康凱瓊脂培養基、4－甲基傘形酮葡糖苷酸(MUG)培養基均由陜西省食品藥品檢驗所提供;9 g/L的無菌氯化鈉溶液，pH為7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液;靛基質試液。供試品奧硝唑膠囊(西安萬隆制藥有限責任公司，規格為0.1 g，批號為060201;規格為0.25 g，批號為060901)。

2 方法與結果

2.1 細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證

2.1.1 菌液制備

取經37℃培養18～24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌肉湯培養物，分別用9 g/L的無菌氯化鈉溶液稀釋至每1 mL含菌50～100 CFU的菌懸液備用;取經25℃培養18～24 h的白色念珠菌液體培養物，用9 g/L的無菌氯化鈉溶液稀釋至每1 mL含菌50～100 CFU的菌懸液備用;取經25℃培養7 d的黑曲霉斜面培養物，加9 g/L的無菌氯化鈉溶液3～5 mL洗下孢子，吸取孢子液，稀釋為每1 mL含50～100 CFU的菌懸液備用。

2.1.2 供試品溶液制備

稱取兩種規格的奧硝唑膠囊各10 g，加pH為7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液100 mL，制備成1∶10的供試液。

2.1.3 方法驗證

常規法:取1∶10的供試液1 mL，分別加入5種試驗菌50～100 CFU，立即注入相應培養基15～20 mL，平行制備2皿，待培養基凝固后，置規定的溫度下倒置培養24～72 h，計算菌落數，作為試驗組，同法測定相應加入的試驗菌數作為菌液組，測定供試品本底菌數作為供試品對照組，按下列公式計算其回收率。試驗組菌回收率(%)=(試驗組平均菌落數－供試品對照組平均菌落數)/菌液組的平均菌落數×100%。結果見表1。

表1 常規法驗證試驗回收率結果(%)

培養基稀釋法:取 1∶10的供試液 0.5 mL和 0.2 mL，分別注入平皿，加入不同的試驗菌50～100 CFU，照常規法進行試驗。結果驗證試驗回收率均為0。

薄膜過濾法:取1∶10供試液1 mL，加入含50 mL稀釋液的薄膜過濾器中，0.45 μm的薄膜過濾后，用pH為7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液300 mL沖洗3次，在最后一次沖洗液中加入50～100 CFU的試驗菌，過濾并充分濾干，取出濾膜貼入預先準備好的營養瓊脂培養基平皿，平行制備2皿，置規定的溫度下倒置培養24～48 h。結果見表 2。

表2 薄膜過濾法驗證試驗回收率結果(%)

2.2 控制菌檢查方法驗證

2.2.1 試驗組

常規法:取1∶10的供試液10 mL，接種至100 mL膽鹽乳糖培養基中，同時加入大腸埃希菌10～100 CFU，35℃培養18～24 h。取培養物0.2 mL，接種到5 mL MUG培養基的試管中，35℃培養24 h左右，在366 nm紫外光燈下觀察熒光，再進行靛基質試驗。另取培養物在麥康凱瓊脂培養基平板上劃線，35℃培養18～24 h，觀察其菌落形態。結果見表3。

培養基稀釋法:取1∶10的供試液10 mL，接種至200 mL膽鹽乳糖培養基中，同時加入大腸埃希菌10～100 CFU，35℃培養18～24 h。照常規法試驗。結果見表3。

薄膜過濾法:取1∶10的供試液10 mL，加入含50 mL稀釋液的薄膜過濾器中，0.45 μm的薄膜過濾后，用pH為7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液300 mL沖洗3次，在最后一次沖洗液中加入50～100 CFU的大腸埃希菌，過濾，取出濾膜加入100 mL膽鹽乳糖培養基中，35℃培養18～24 h。照常規法試驗。結果見表3。

表3 控制菌大腸埃希菌驗證試驗結果

2.2.2 陰性對照組

取1∶10的供試液10 mL，加入含50 mL稀釋液的薄膜過濾器中，0.45 μm的薄膜過濾后，用pH為7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液300 mL沖洗3次，在最后一次沖洗液中加入10～100 CFU的金黃色葡萄球菌，過濾，取出濾膜加入100 mL膽鹽乳糖培養基，35℃培養18～24 h。照常規法試驗。結果見表3。

3 討論

表1結果顯示，對于兩種規格的奧硝唑膠囊，采用常規法對5種試驗菌進行驗證，白色念珠菌和黑曲霉的回收率均高于70%，而金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的回收率均為0，表明奧硝唑膠囊對霉菌和酵母菌無抑制作用，對細菌有很強的抑制作用。為了有效消除奧硝唑膠囊的抑菌成分，采用培養基稀釋法(0.5 mL/皿、0.2 mL/皿)，結果與常規法相同，也無法消除兩種規格奧硝唑膠囊對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的抑制作用。說明這兩種方法均不能用于該藥品的細菌數測定。由表2結果可知，采用薄膜過濾法(供試液1 mL/膜，沖洗量300 mL/膜，分3次沖洗)，可消除兩種規格的奧硝唑膠囊對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的抑制作用，回收率均明顯高于70%。表3結果顯示，奧硝唑膠囊控制菌檢查方法采用薄膜過濾法，加入大腸埃希菌后MUG呈現熒光，靛基質試液液面呈玫瑰紅色，陰性對照菌則無此現象。因此，兩種規格的奧硝唑膠囊控制菌大腸埃希菌檢查均需采用薄膜過濾法。

兩種規格的奧硝唑膠囊均可采用薄膜過濾法，即用pH為7.0的氯化鈉－蛋白胨緩沖液300 mL分3次進行沖洗，測定細菌數和進行控制菌大腸埃希菌的檢查;采用常規法對霉菌和酵母菌數進行測定。薄膜過濾法能有效消除奧硝唑的抑菌作用，方法準確、可靠，可有效控制奧硝唑膠囊的質量。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學工業出版社，2005:附錄 71－73.

[2]許霞光，秦紅霞，曾廣霞.婦科千金膠囊配伍奧硝唑膠囊治療慢性盆腔炎 150例[J].現代中醫藥，2009，29(6):39－40.

[3]李惠娥.14種化學藥品微生物限度檢查方法驗證結果及分析[J].西北藥學雜志，2007，22(6):325 －327.