腎病綜合征大鼠腎組織中腫瘤壞死因子α的變化及霉酚酸酯對其影響

韓丹，姜紅

（中國醫科大學 附屬第一醫院兒科，沈陽 110001）

原發性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PSN）是最為常見的小兒腎小球疾病之一。腎病綜合征的發病機制至今仍不清楚，近年研究證明，腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factar-α，TNF-α）可能參與PSN發病［1］，監測血清TNF-α水平有助于判定病情和預后［2］。然而目前有關PSN腎臟組織中TNF-α變化的報道很少。PSN治療雖然仍以糖皮質激素為主，并使大部分患者得以緩解，但復發、頻復發、激素依賴、激素耐藥等問題仍然是臨床治療的難題。霉酚酸酯（mycophenolate mofetil，MMF）是一種新型免疫抑制劑，近年已逐漸用于難治性腎病的治療，并被證實安全有效［3，4］，但是 MMF 治療 PSN 的機制仍不十分清楚。

本研究通過構建大鼠腎病綜合征模型，討論腎組織中TNF-α與PSN的關系，觀察MMF對大鼠腎病綜合征的實驗室指標、腎臟組織學及腎組織中TNF-α變化的影響，為MMF用于人類PSN的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：健康雄性純種Wistar大鼠36只，SPF清潔級，周齡 6～8周，體質量 170～210 g，購至中國醫科大學實驗動物中心。

1.1.2 用藥及試劑：鹽酸阿霉素（意大利法瑪西亞普強公司）、霉酚酸酯（上海羅氏制藥有限公司）、腫瘤壞死因子α免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）、SABC試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）、DAB顯色劑（福州邁新生物技術開發有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及給藥方法：將36只Wistar大鼠隨機分3組：腎病綜合征組（A組）、酶酚酸酯干預組（B組）、正常對照組（C組），每組各12只。其中A、B均制成腎病綜合征模型，B組從實驗第1天給予MMF干預，劑量按20 mg/kg，每日1次，灌胃，共28 d，A組、C組從第1天給予0.4 ml生理鹽水，每日1次，灌胃，共 28 d。

1.2.2 腎病綜合征模型的建立：于實驗第1天，A組和B組按Bertain方法［5］制作腎病綜合征模型，即非麻醉下一次性尾靜脈注阿霉素（6.5 mg/kg），C組同法注射等量生理鹽水。

1.2.3 觀察指標：將大鼠于實驗 1、7、14、21、28 d 置于代謝籠中，收集24 h尿液，測24 h尿蛋白定量。各實驗組于實驗14、21、28 d分別處死4只，取出雙腎，切成小塊以2.5%戊二醛或4%多聚甲醛固定，以備切片進行光鏡、TNF-α免疫組化檢測及電鏡檢查。

1.2.4 免疫組化結果的判定：細胞質呈棕黃色著染的為陽性細胞。TNF-α表達的強度用MetaMorph offline圖像分析系統測定，每張切片在高倍（×400）下測定5個視野的平均積分光密度值（integral optical density，IOD），取其平均值表示。

1.3 統計學分析

計量資料以x±s表示，利用SPSS13.0軟件,采用單因素方差分析，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 24 h尿蛋白定量

實驗14 d之后，A組和B組大鼠24 h尿蛋白定量顯著高于C組（P<0.01），造模成功；A組24 h尿蛋白定量逐漸增多；B組24 h尿蛋白定量均顯著低于A組（P<0.01），實驗21 h達高峰，28 d與21 d相比明顯下降。見表1。

表1 各組24 h尿蛋白定量水平的比較（x±s）Tab.1 24-hour urine protein quantity of each group（x ±s）

2.2 光鏡

實驗28 d各組腎小球和腎小管均未見明顯變化。本實驗A、B組光鏡表現符合微小病變型腎病。見圖1。

2.3 電鏡

實驗28 d，A組大鼠腎臟均出現腎小球上皮細胞腫脹、空泡形成、廣泛足突融合；而B組大鼠腎臟也出現腎小球上皮細胞腫脹、空泡形成，但僅部分足突出現融合；C組腎小球上皮細胞正常。見圖2。

2.4 免疫組化

TNF-α主要表達于腎小管細胞胞質中，腎小球細胞胞質中也有少量表達，陽性產物呈棕黃色顆粒。在實驗 14、21、28 d，A 組大鼠腎臟中 TNF-α 的表達均顯著強于B組、C組（P<0.01），并隨實驗的進行表達顯著增加；而B組TNF-α的表達均弱于A組（P<0.01），強于 C 組（P<0.01），并在實驗 21 d達高峰；C組TNF-α在腎臟組織中表達較少，各個時期強度不變。見表2，圖3。

表2 各組大鼠腎組織中TNF-α表達的IOD的變化（x±s）Tab.2 The average integrate OD value changes of TNF-α in rat renal tissues（x ±s）

3 討論

小兒PNS發病機制，現認為與淋巴細胞功能紊亂有關，炎性細胞因子在腎病綜合征的發生、發展中起重要作用［6］。TNF-α 主要由激活的單核/巨噬細胞、T淋巴細胞所產生，腎臟固有細胞，如系膜細胞、內皮細胞、腎小管上皮細胞也能產生。TNF-α具有多向性生物活性，可造成炎性損傷［7］，TNF-α 可促進許多分子的表達，如IL-8等，這些生物分子會使系膜細胞和內皮細胞通透性增加。

本研究通過構建大鼠腎病綜合征模型，討論腎組織中TNF-α與原發性腎病綜合征發病的關系，實驗中A組TNF-α在腎臟組織中隨著病程表達逐漸增多，與C組相比表達顯著增強。說明了腎組織中TNF-α可能參與原發性腎病綜合征發病。

糖皮質激素及細胞毒性藥物雖然可使大部分患者得以緩解，但由于對人體細胞的選擇性差，在抑制異常的免疫反應同時，也抑制人體其他細胞的正常功能，因此毒副作用大。MMF是一種新型免疫抑制劑，其特點是選擇性地抑制鳥嘌呤的經典合成途徑［8］，對淋巴細胞增殖的抑制具有高度的選擇性，而對肝細胞、骨骼細胞等其他細胞無影響，MMF已逐漸用于難治性腎病的治療。

本實驗證實了MMF可緩解原發性腎病綜合征病情。實驗中B組TNF-α在腎臟組織中表達弱于A組，略強于C組，并隨干預的進行在實驗21 d后減弱。說明了MMF治療腎病綜合征的機制可能與腎組織中TNF-α水平的減少有關。

綜上所述，大鼠腎病綜合征模型腎組織中的TNF-α增高。MMF可能通過降低腎組織中TNF-α的增高，減少蛋白尿，減輕腎組織的損傷。

［1］Rizk MK，El-Nawawy A，Abdel-Kareem E，et al.Serum interleukins and urinary microglobulin in children with idiopathic nephrotic syndrome［J］.East Mediterr Health J，2005，11（5-6）：993-1002.

［2］Pogan A，Sancewicz-Pach K，Miezyński W.TNF-alpha and soluble interleukin-2 receptor and glomerular sclerosis in primary nephrotic syndromein children［J］.Wiad Lek，2005，58（Suppl1）：39-44.

［3］Paydas S，Kurt C，Taskapan H，et al.The effect of mycophenolate mofetil on primary and secondary treatment of primary glomeru－lonephritisand lupusnephritis［J］.Int Urol Nephrol，2009，41（1）：145-152.

［4］Gellermann J，Querfeld U.Frequently relapsing nephritic syndrome：treatmentwithmycophenolatemofeil［J］.Pediatr Nephrol，2004，19（1）：101-104.

［5］Bertain T，Andreina P，Bid D，et al.Adriamycin-induced nephrotic syndromein rat［J］.Lab Invest，1982，46：16.

［6］Tripathi G，Jafar T，Mandal K，et al.Does cytokine gene polymorphism affect steroid responses in idiopathic nephrotic syndrome?［J］.Indian JMed Sci，2008，62（10）：383-391.

［7］Laflam PF，Garin EH.Effect of tumor necrosis factor alpha and vascularpermeabilitygrowthfactoronalbuminuriainrats［J］.PediatrNephrol，2006，21（2）：177-181.

［8］Ulinski T，Aoun B.Pediatric idiopathic nephrotic syndrome：treatment strategies in steroid dependent and steroid resistant forms［J］.Curr Med Chem，2010，17（9）：847-853.