姜黃素對APP/PS1轉基因鼠TNF-α、IL-6的影響

王銅浩，楊茂偉，顏培培，初立偉，高志達

（中國醫科大學 附屬第一醫院 1.骨科；2.內分泌科，沈陽 110001）

老年癡呆癥，又稱阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，簡稱AD），是一種神經退行性疾病。目前，在臨床研究中有關AD患者體內細胞因子的研究已有很多報道［1~2］，但其變化規律以及姜黃素治療劑量對其變化規律影響的研究尚不多見。APP/PS1轉基因鼠（β淀粉樣蛋白前體蛋白/早老素1）可表達與AD相關的突變基因，是研究AD及其并發癥有力的動物模型［3］。姜黃素（curcumin）是從姜科植物姜黃中提取的一種酚類物質，具有抗炎、抗氧化、減少小膠質細胞形成、能改善AD病人的認知功能［4］，本實驗以APP/PS1轉基因鼠做為AD模型，通過檢測鼠模型應用姜黃素治療前后腦及血清中的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的含量，探討 APP/PS1 轉基因鼠體內細胞因子TNF-α和IL-6的變化規律以及不同藥量的姜黃素對其變化規律的影響，為AD防治方面的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：6月齡雌性APP/PS1轉基因小鼠（B6C3-Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo/J，購自美國 Jackson Laboratory），經過常規飼養，傳代后選擇體質量（20±1）g小鼠36只，再從中隨機選取9只小鼠作為模型組，其余27只小鼠隨機分為3組作為用藥組，除常規飲食外，姜黃素（Sigma公司，純度>96%）按60，160，600 mg·kg-1加入小鼠飼料，自由飲水。6 月齡雌性野生型小鼠（C57bl/6）9只，（20±1）g為對照組。各組小鼠分籠飼養，常規飲食，室溫23～25℃，12 h間隔照明，定期紫外線消毒與通風。

1.2 方法

1.2.1 取材及標本制備：每組小鼠各取3只分別于9、12、18月齡時處死，無菌取大腦、血漿，大腦勻漿后上清液和血漿離心后的血清于-80℃保存備測。

1.2.2 檢測方法：分別應用Quick EIATM小鼠TNF-αELISA試劑盒和Quick EIATM小鼠IL-6 ELISA試劑盒（Dakewe biotech Company Limited）檢測各年齡段小鼠腦組織上清液和血清中的細胞因子TNF-α和IL-6表達水平，按照試劑盒要求進行操作，檢測程序和結果計算與判斷基本相同。

1.2.3 結果計算與判斷：（1）所有OD值都應減除空白值后再行計算。（2）以標準品之OD值在半對數紙上作圖，畫出標準曲線。（3）根據樣品值在該線圖上查出相應小鼠TNF-α和IL-6含量。

1.3 統計學分析

使用SPSS13.0統計軟件進行分析檢驗，所有數值以x±s的形式表示，兩樣本均數比較用t檢驗，多樣本均數比較采用ANOVA進行分析，P<0.05為有統計學差異。

2 結果

應用ELISA技術分別于9、12、18月齡時檢測各組小鼠的腦組織和血清中的細胞因子TNF-α和IL-6表達水平，結果見表1。

表1 姜黃素對APP/PS1轉基因鼠TNF-α、IL-6的影響Tab.1 The effect of curcumin on TNF-αand IL-6 in APP/PS1 transgenic mice

與對照組（野生型小鼠）相比，模型組（APP/PS1轉基因鼠）腦組織和血清中的TNF-α和IL-6于9月齡時開始升高，且IL-6的變化出現統計學差異（P＜0.05）；12月齡差異有統計學意義（P＜0.05）；18月齡差異有統計學意義（P＜0.01），并且轉基因小鼠體內的炎性因子隨著年齡的增長，病情的加重出現上升趨勢，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

與模型組相比，用藥組姜黃素60 mg·kg-1腦組織和血清中的TNF-α和IL-6表達水平降低；姜黃素160 mg·kg-1出現顯著性差異（P<0.05）；姜黃素 600 mg·kg-1差異更加顯著（P<0.01），TNF-α 和 IL-6 的含量接近對照組（P ＞ 0.05）；姜黃素 600 mg·kg-1各年齡段小鼠相比，TNF-α和IL-6含量無統計學差異（P＞0.05）。

3 討論

臨床研究顯示細胞因子在AD的神經病理損傷過程中起重要作用［1］。對AD患者的病歷檢查結果證實，海馬各區TNF-α呈高表達，并認為它是介導AD腦內炎性病理反應的關鍵性因子，對AD患者的皮質研究發現，IL-6的腦內表達也顯著增多。因此，若能抑制TNF-α和IL-6的分泌，就可減慢甚至調整這種惡性循環，從而減少腦神經細胞的死亡或凋亡，而達到防治AD的目的。

大量的研究證據表明姜黃素可以抑制AD患者腦內 β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）的沉積，改善AD患者的免疫功能［5］，更重要的是姜黃素具有抗炎和抗氧化的作用［6］。Yang等［7］研究發現姜黃素可通過調節APP/PS1轉基因小鼠體內的炎性因子而改善其骨微結構，可見炎性因子對AD及其并發癥有著重要的作用。因此，本實驗以APP/PS1轉基因小鼠做為AD模型，探討了轉基因鼠隨著病情的發展，體內細胞因子TNF-α和IL-6的變化規律，以及不同藥量的姜黃素對其變化規律的影響。

通過對比實驗數據可發現與野生型小鼠相比，APP/PS1轉基因鼠腦組織、血清中的TNF-α和IL-6于9月齡時開始升高，12月齡時差異顯著（P<0.05），18月齡時差異更加顯著（P<0.01）。有研究發現APP/PS1轉基因小鼠在9月齡時開始表達Aβ，并隨著年齡的增加表達升高［8］，由此可見轉基因小鼠體內的TNF-α和IL-6的變化趨勢可能和Aβ的表達密切相關，而Aβ是淀粉樣前體蛋白（APP）基因編碼的產物是，Aβ出現以后一方面可刺激大腦局部的單核巨噬細胞和小膠質細胞產生TNF-α和IL-6［9］，同時由于其血腦屏障局部功能發生改變，使局部升高TNF-α和IL-6進入體循環；另一方面Aβ的表達可導致免疫系統功能的改變，與局部的炎性應答相互作用，從而導致了機體細胞因子的升高。因此可間接推測APP/PS1轉基因小鼠體內TNF-α和IL-6的表達升高和APP、PS1基因存在一定的關聯。

應用姜黃素60 mg·kg-1治療后，APP/PS1轉基因鼠腦組織、血清中TNF-α和IL-6表達水平降低，160 mg·kg-1治療后出現顯著性差異（P<0.05），600 mg·kg-1時差異更加顯著（P<0.01）?？梢姂媒S素劑量600 mg·kg-1時能夠有效的抑制APP/PS1轉基因鼠體內的細胞毒性因子的產生。研究［10］證實姜黃素用藥在150～750 mg·kg-1對治療去勢后小鼠的骨質疏松效果顯著，且無毒副作用。本實驗中姜黃素的最高用藥量為600 mg·kg-1，小鼠估計攝入量為 1.2～12 mg·kg-1，2 000 mg·kg-1是姜黃素毒性臨界值［11］，該值遠遠大于我們的用藥量，因此600 mg·kg-1用藥量對生物體幾乎毒害作用，且較非甾體等其它抗炎藥。姜黃素負面作用更低。所以每組小鼠都不存在死亡率。Baum等［12］研究發現姜黃素在AD患者腦內可做為螯合劑結合Aβ周圍的鐵、銅離子，從而加速Aβ的降解。在體內研究還發現姜黃素可抑制氧化應激反應，保護細胞免受Aβ的攻擊。因此姜黃素可通過影響Aβ的表達，抑制APP/PS1轉基因鼠體內的炎性反應，降低TNF-α和IL-6的含量，從而可有效緩解AD的病情。

上述研究提示APP/PS1轉基因小鼠可通過表達突變的APP、PS1基因編碼Aβ，Aβ的形成和發展導致了轉基因小鼠體內細胞因子TNF-α及IL-6的升高，在闡明轉基因小鼠體內細胞因子變化規律的同時，探討了不同藥量的姜黃素對其變化規律的影響，為在人體中進一步研究AD的防治奠定了基礎。

［1］Rosenberg PB.Clinical aspects of inflammation in Alzheimer’s disease［J］.Int Rev Psychiatry，2005，17（6）：503-514.

［2］Mrak RE，GriffinWS.Interleukin-1，neuroinflammation，and Alzheimer’sdisease［J］.Neurobiol Aging，2001，22（6）：903-908.

［3］Janus C，Westaway D.Transgenic mouse models of Alzheimer’s disease［J］.Physiol Behav，2001，73（5）：873-886.

［4］Ng TP，Chiam PC，Lee T，et a1．Curry concumption and cognitive functionin theelderly［J］.Am JEpidemio，2006，164（9）：898-906.

［5］Ono K，Hasegawa K，Naiki H，et al.Curcumin has potent anti-amyloidogenic effectsfor Alzheimer′s beta-amyloid fibrilsin vitro ［J］.J Neurosci Res，2004，75（6）：742-750.

［6］Motterlini R，Foresti R，Bassi R，et al.Curcumin，an antioxidant and anti-inflammatory agent，inducesheme oxygenase-1 and protectsendothelial cells against oxidative stress ［J］.Free Radic Biol Med，2000，28（8）：1303-1312.

［7］Yang MW，Wang TH，Yan PP，et al.Curcumin improves bone microarchitecture and enhances mineral density in APP/PS1 transgenic mice［J］.Phytomedicine，2010，29（9）：789-799.

［8］Liu L，Ikonen S，Heikkinen T，et al.Effects of fimbria-fornix lesion and Amyloid pathology on spatial learning and memory in transgenic APP+PS1 mice［J］.Behav Brain Res，2002，134（1-2）：433-445.

［9］Chong YH，Sung JH，Shin SA，et a1.Effectsof the beta-amyloid and carboxyl-terminal fragment of Alzheimer’s amyloid precursor protein on the production of the tumor necrosis factor-alpha and matrix metallop-roteinase-9 by human monocytic THP-1［J］.Biol Chem，2001，27（19）：23511-23517.

［10］French DL，Muir JM，Webber CE.The ovariectomized，mature rat model of postmenopausal osteoporosis：An assessment of the bone sparingeffectsof curcumin.Phytomedicine，2008，15 （12）：1069-1078.

［11］Lim GP，Chu T，Yang F，et a1.The curry spice curcumin reduces oxidativedamageand amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse［J］.JNeurosci，2001，21（21）：8370-8377.

［12］Baum L，Ng A.Curcumin interaction with copper and iron suggests one possible mechanism of action in Alzheimer’s disease animal models［J］.JAlzheimers Dis，2004，6（4）：367-377.