超聲介導微泡對內皮祖細胞一氧化氮及一氧化氮合酶活性的影響

魏紅，童嘉毅，范國峰，馮毅，李鵬

（1.東南大學醫院，南京 210018；2.東南大學 附屬中大醫院，南京 2100092；3.南京大學醫學院 附屬鼓樓醫院，南京 210008）

急性心肌梗死是全球范圍內嚴重威脅人類健康的臨床常見病。藥物治療和血運重建技術的不斷發展，使急性心肌梗死的死亡率明顯降低，但對心肌梗死后心力衰竭仍無有效的治療手段。近年來，許多臨床研究提示干細胞移植治療缺血性心臟病，能夠改善心肌功能，但治療效果仍不肯定，甚至相互矛盾。本課題組初步動物實驗結果表明，超聲介導微泡能夠增加豬骨髓單個核干細胞歸巢至局部梗死心肌的能力，遠期心功能得到明顯改善［1，2］，并且對移植干細胞增殖、凋亡和細胞周期無不良影響［3］。然而，超聲介導微泡增強移植干細胞靶向歸巢的機制仍不明確。本實驗觀察超聲介導微泡對內皮組細胞（endothelial progenitor cells，EPCs） 生成一氧化氮（nitric oxide，NO）的量及一氧化氮合酶（nitrogen synthase，NOS）活性的影響，以了解其增效干細胞治療的機制，從而進一步指導實驗和臨床研究。

1 材料與方法

1．1 主要試劑和設備

淋巴細胞分離液Ficoll-Paque（天津灝洋生物公司），培養液 EGM-2（Cambrex），纖維連接蛋白（Fn，Chemicon）；Di I標記乙酰化低密度脂蛋白（Di I-acLDL，Molecular Probe），FITC 標記荊 豆 凝集 素 I（FITC-UEA-I，Sigma），硝酸還原酶法測定NO試劑盒（南京建成生物工程研究所），NOS分型測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），含氟碳氣體脂質體微泡（東南大學生物工程材料國家重點實驗室），熒光正立顯微鏡（Nicon），CZT-3超聲同步治療儀（沈陽新樂康復醫療儀器廠），3722N型可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）。

1.2 細胞分離、培養和鑒定

于雄性豬（2月齡中國家豬，東南大學實驗動物中心提供）脛骨近端抽取骨髓約20 ml，加入Ficoll-Paque分離液，采用密度梯度離心法分離單個核細胞，以3×105/ml的密度，接種于鋪有Fn的培養瓶中，培養液用EGM-2。培養至7 d行DiLacLDL和FITC-UEA-I雙染色，記數雙陽性細胞為EPCs。

1.3 內皮祖細胞的分組和干預

培養細胞分為3組：對照組、超聲組和超聲微泡組。實驗前將培養的EPCs用胰酶消化，制成單細胞懸液，搖勻后以100μl（約5×105/ml）加入96孔培養板。對照組不做干預，超聲組以頻率1 MHz，輸出功率1W/cm2，持續輻照90 s；超聲微泡組加入5μl微泡（約 2×108/ml），以同樣超聲條件作用 90 s。96 孔培養板固定在37℃雙蒸水水槽表面，超聲探頭垂直置于培養板下方約8 cm處，為避免超聲波對鄰近孔細胞的影響，隔孔接種細胞，每組8孔。干預后分別收集細胞和上清液。

1．4 內皮祖細胞生成NO和NOS活力測定

應用NO試劑盒通過硝酸還原酶法檢測EPCs上清液NO含量；應用NOS分型測定試劑盒測定EPCs細胞內結構型NOS（cNOS）和誘導型NOS（iNOS）的含量。

1.5 統計學分析

采用SPSS14.0統計軟件包進行數據分析，所有數據用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Student Newman Keuls（S-NK）檢驗，P﹤0.05為有統計學差異。

2 結果

2．1 內皮祖細胞的鑒定結果

培養7 d，貼壁細胞形態以梭形為主，可見圓形及不規則形細胞。熒光顯微鏡下，細胞攝取DiLac LDL后呈紅色，FITC-UEA-I染色后呈綠色，雙染色細胞的EPCs占90%以上（圖1）。

2．2 超聲聯合微泡對EPCs生成NO的影響

硝酸還原酶法檢測EPCs干預后的上清液，結果表明：超聲組為（70.43±9.52）μmol/L，與對照組（72.85±9.08）μmol/L無顯著性差異；超聲微泡組為（88.70±8.78）μmol/L，與對照組和超聲組均有顯著性增加（P<0.05）。

2．3 超聲聯合微泡對EPCs各型NOS活力的影響

對照組、超聲組和超聲微泡組T-NOS活力分別為（8.33±1.05）U/ml、（7.81±0.82）U/ml、（15.60±1.26）U/ml；i-NOS 活力 3 組分別為 （5.50±0.47）U/ml、（5.25±0.50）U/ml、（10.81±0.95）U/ml；T-NOS 活力減去i-NOS可得到c-NOS活力分別為（2.82±0.24）U/ml、（2.56±0.30）U/ml、（4.78±0.36）U/ml。統計學分析表明，超聲組各型NOS活力較對照組有所下降，但差異無統計學意義；而超聲微泡組i-NOS和c-NOS活力較對照組有顯著性增加（P<0.05），又以i-NOS增加更明顯（圖2）。

3 討論

移植干細胞治療缺血性心肌病的關鍵是移植細胞到達缺血區并存活，并進一步分化為心肌細胞或發揮旁分泌治療作用。NO是體內活性氣體分子，有廣泛生理病理作用，包括調節血管舒張功能，抗血小板聚集，增加血管通透性，促進血管新生，調節其他促血管生長因子功能。體內NO由NOS催化L-精氨酸與氧分子經多步氧化還原反應生成。不同類型細胞中，存在不同類型的NOS，通過不同的信號轉導機制產生NO。現已知NOS有3種類型，廣義的將其分為2種，即構成型一氧化氮合酶（cNOS）和細胞因子誘導型（iNOS）。cNOS包括主要分布在內皮組織的eNOS和神經系統的nNOS，合成基礎NO，調節生理功能。iNOS在靜息細胞內不表達，當細胞受到細胞因子或炎性刺激時，催化合成非生理濃度的大量NO。

本實驗結果證實，超聲介導微泡作用下EPCs生成NO明顯增加，EPCs各亞型NOS活性均有所增強，又以i-NOS增加更明顯。可以推測，體內血管局部NO濃度增加，從而引起血管擴張，血流速度減慢，有利于EPCs邊集。近期實驗表明［4］，NO能夠降解內皮層鈣黏蛋白復合物，激活金屬蛋白酶-9（MMP-9）降解細胞外基質，使血管通透性增加，促進EPCs游出血管，在心肌組織間遷移。此外，動物實驗表明［5，6］，心肌局部 NO 生成增加，能夠增強大鼠心肌梗死區血管新生，改善心肌纖維化和心功能，提高生存率。

eNOS在EPCs遷移、分化形成微血管中也起重要作用。Sasaki等［7］應用eNOS增強子AVE9488體外預處理EPCs，eNOS mRNA表達增加，相應酶活性增強，結果使干細胞遷移能力明顯提高；體內實驗進一步表明上述預處理移植EPCs能夠明顯增加缺血后肢新生血管密度和血流灌注，改善后肢運動功能。而且NOS活性對心肌缺血和再灌注損傷也有保護作用，其機制可能與移植EPCs的eNOS、iNOS活性和分泌VEGF有關，其中eNOS對一過性缺血，iNOS對慢性持續缺血有抗炎性作用［8］。

綜上所述，超聲（1 MHz，1W/cm2，90 s）介導微泡能夠增強EPCs的NOS活性，增加NO生成，可能影響EPCs的黏附、遷移、存活、增殖和分化的各個環節，從而發揮增強干細胞治療心肌梗死的作用。目前該作用的具體機制尚不明確，尚需相關實驗進一步深入研究。

［1］童嘉毅，馬根山，馮毅，等．超聲波促骨髓間充質干細胞心肌內歸巢的實驗研究［J］．中國心血管病研究雜志，2008，6（10）：771-773．

［2］徐琢，馮毅，童嘉毅，等．超聲微泡輔助干細胞移植治療急性心肌梗死的實驗研究［J］．東南大學學報（醫學版），2008，27（3）：192-194．

［3］范國峰，馮毅，童嘉毅，等．超聲聯合微泡對內皮祖細胞體外增殖、凋亡及細胞周期的影響［J］．東南大學學報（醫學版），2009，30（2）：109-112．

［4］Dong Y，Ludovic W，Téni G，et al.Increase in vascular permeability and vasodilation are critical for proangiogenic effects of stem cell therapy［J］．Circulation，2006，114（4）：328-338．

［5］Landmesser U，Engberding N，Bahlmann FH，et al．Statin-induced improvement of endothelial progenitor cell mobilization，myocardial neovascularization，left ventricular function，and survival after experimental myocardial infarction requires endothelial nitric oxide synthase［J］．Circulation，2004，110（14）：1933-1939．

［6］Bulhak AA，Sjoquist PO，Xu CB，et al．Protection against myocardial ischaemia/reperfusion injury by PPAR-alpha activation is related to productionofnitricoxideand endothelin-1［J］．Basic ResCardiol，2006，101（3）：244-252．

［7］Sasaki K，Heeschen C，Aicher A，et al．Ex vivo pretreatment of bone marrow mononuclear cells with endothelial NO synthase enhancer AVE9488 enhances their functional activity for cell therapy［J］．Proc Nat Acad Sci USA，2006，103（39）：14537-14541.

［8］Masaaki I，Hiromi N，Atsushi I，et al．Endothelial progenitor cells are rapidly recruited to myocardium and mediate protective effect of ischemic preconditioning via“imported”nitric oxide synthase activity［J］．Circulation，2005，111（9）：1114-1120．