Notch-1及Jagged-2基因在肛門直腸畸形大鼠直腸發育過程中的表達及意義

賈慧敏，王曉東，陳青江，張濤，王維林

（1.中國醫科大學 附屬盛京醫院小兒外科，衛生部小兒先天畸形重點實驗室，沈陽 110004；2.沈陽市第四人民醫院普外科，沈陽110031）

肛門直腸畸形（anorectal malformations，ARM）術后排便功能障礙與神經肌肉的異常發育導致腸道動力改變密切相關，然而ARM神經肌肉發育異常的機制至今仍不清楚，與ARM的胚胎發生機制是否相通也不明了［1］。目前認為Notch信號通路在調控細胞生長分化、組織更新及調節細胞內環境穩定中發揮重要作用［2，3］。Notch信號通路尤其在胃腸道的胚胎發育過程中起著重要作用［4］。Notch-1及其配體Jagged-2是表達于腸道基質的兩種重要的Notch通路中的成員，但迄今為止其復雜的調控機制仍不清楚，是否參與ARM發生后末端直腸的發育也無報道。本研究通過對Notch-1及Jagged-2基因在E16~E21的正常及ARM大鼠胚胎直腸的表達情況來探討它們可能在ARM大鼠胚胎的直腸發育中的調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用體質量為220～250 g健康成熟未育的Wistar大鼠75只，雌鼠60只，雄鼠15只（購自中國醫科大學附屬盛京醫院實驗動物中心）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與取材：按雌雄比例4∶1晚上合籠過夜，次日晨雌鼠做陰道涂片。在光鏡下見到精子即提示交配，當日為孕0 d（E0），并隨機分為2組。ETU組：40只孕鼠于E10時按125 mg/kg給予1%乙烯硫脲（ethylenethiourea，ETU）經胃管注入大鼠胃內；對照組：20只灌入等量蒸餾水，繼續保持妊娠。ETU組和對照組大鼠分別做以下處理：于E16~E21根據計劃選取一定數量各胎齡的孕鼠，在10%水合氯醛（4 m1/kg）腹腔注射麻醉下，應用解剖顯微鏡（放大倍數7.5～64倍）行剖宮術，取出所有胎鼠，其中E16胚胎取整個胚胎，E17~E21胚胎取其盆部，所有標本經0.01 mol/LPBS液沖洗。部分E17、E19、E21的對照組和ETU組的胎鼠，在顯微鏡下辨別畸形后進一步分為正常組和ARM組，無菌條件下取直腸末端/盲端部分置于EP管中于-80℃深凍保存，備Western blot及RT-PCR用。其余標本置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定12~36 h，常規脫水，石蠟包埋，制成蠟塊。

1.2.2 免疫組化方法：對照組及ETU組的胎鼠正中矢狀面及橫斷面連續切片，根據鏡下觀察進一步分為正常組和ARM組，進行Notch-1及Jagged-2一抗（1∶150）免疫組化染色。連續動態對比觀察Notch-1及Jagged-2在正常和畸形大鼠胚胎結直腸發育過程中的表達。免疫組化染色具體步驟：加入一抗，4℃孵育12 h。二抗采用S-P試劑盒，DAB顯色經蘇木素復染，脫水、透明后封片。Notch-1及Jagged-2免疫組織化學染色見胞漿呈棕黃色為陽性，該細胞為陽性細胞。每次染色均設陰性和陽性對照。采用NISElements Basic Research多媒體彩色病理圖像分析系統對Notch-1及Jagged-2的表達進行圖像分析。

1.2.3 Western blot方法：（1）顯微鏡下取新鮮末端直腸組織應用南京凱基全蛋白提取試劑盒提取總蛋白。其含量按改良Lowry法測定，于-20℃凍存備測。（2）Western雜交：取總蛋白 40μl，經6%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉移至硝酸纖維膜（Invitrogen公司）上，5%牛血清白蛋白封閉抗原后，加入Notch-1及Jagged-2抗體（1∶200）和 β-actin抗體（1∶5 000），4℃孵育 12 h。次日洗膜后加堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG（1∶2 000）進行二抗雜交、顯色。結果采用GIS-2020凝膠圖象分析系統掃描分析結果，對蛋白質含量進行密度分析，以相對灰度值代表蛋白表達量。

1.2.4 RT-PCR檢測組織中Notch-1、Jagged-2 mRNA的表達：（1）總 RNA 提取；（2）逆轉錄合成 cDNA，逆轉錄試劑盒購于Takara公司，采用試劑盒推薦方法。（3）Notch-1、Jagged-2基因的 PCR擴增：引物設計參考美國國立醫學圖書館Medline基因庫，利用Primer 5.0版軟件設計引物，由上海Invitrogen生物技術有限公司合成，各基因引物序列及擴增條件見表1。（4）瓊脂糖凝膠電泳。用G：BOX SYNGENE凝膠分析系統拍照，以Kodar Digital Science 1.0 DNA分析軟件系統對PCR產物進行半定量分析。以βactin內參照相對密度mass（ng）值標化Notch-1、Jagged-2 mRNA的mass值，得到相對含量進行分析。

1.3 統計學分析

所有數據均以x±s表示，差異比較采用SPSS 13.0統計軟件進行t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體實驗結果

對照組共產胎仔192只，未見畸形。ETU組中221只出現ARM，畸形率為61.1%；均為直腸尿道瘺和泄殖腔畸形。根據切片觀察及顯微鏡下觀察后分為正常組（n=120）和ARM組（n=150）進行本實驗。

2.2 Notch-1及Jagged-2大鼠胚胎期直腸壁內的表達情況

表1 Notch-1、Jagged-2及β-actin引物序列及擴增片段長度Tab.1 Primer sequences and product size of Notch-1，Jagged-2 andβ-actin amplification

2.2.1 免疫組化染色結果：正常組：E16時，腸壁各層發育尚不清晰，并未觀察到明顯的陽性細胞；E17時，直腸壁環肌層逐漸發育，并可見陽性細胞群位于肌肉細胞內，黏膜層也有表達；E19-20，腸壁肌層發育逐漸完善，縱肌層開始分化，并可見大量陽性細胞位于腸道平滑肌及腸間神經叢部位（myenteric nerve plexus，MP）和黏膜層。ARM組：E16時，可以觀察到所有標本短尾或無尾，直腸尿道間存在瘺管；直至E17時，直腸盲端及瘺管周圍均并未見到陽性細胞表達；E19后，上位結腸可見大量陽性細胞位于腸壁內；隨著接近盲端，腸壁各層分化不良，盲端已經見不到正常腸壁結構，陽性細胞分布逐漸減少，橫斷面上更顯示出瘺管周圍肌肉形態異常，也不能看到神經叢結構；E20~21，這種變化更加明顯（圖1、2）。

Jagged-2在大鼠胚胎期直腸壁內的表達情況：免疫組化結果提示Jagged-2的表達時空分布與Notch-1相同（圖略）。

2.2.2 Western blot結果：在17 d以后，Notch-1在正常組和ARM組都有表達，E17~21時正常組的表達較致畸組明顯增強，具有統計學差異（圖3，表2）。

2.2.3 RT-PCR結果：在17 d以后，Notch-1在正常組和ARM組都有表達，E17~21時正常組的表達較致畸組強，差異有統計學意義（圖4，表2）。

3 討論

肛門直腸畸形術后排便功能障礙與末端直腸的神經肌肉的異常發育導致腸道動力改變密切相關，而腸管的神經肌肉的形成過程非常復雜，受多種因素調控。

目前研究認為Notch信號通路對于胃腸道的胚胎形成、腸神經嵴干細胞（gut neural crest stemcells，GNCSC）的遷移增殖、分化及腸壁平滑肌的發育都有影響［5，6］。并在多種細胞的分化過程中起關鍵作用的通路［7］。Notch是一種進化保守的跨膜蛋白受體，Notch胞外區與相鄰細胞表面的配體結合后被蛋白酶體切割，釋放出具有核定位信號的胞內域NICD（intracelluar domain of Notch），NICD 進入細胞核后借助于RAM域和ankyrin重復序列與RBP-JK/CBF-1和Mastermind相互作用形成轉錄激活復合物，調控Hes和Hey家族基因等基因的表達［8］。Notch信號通路在中樞神經系統，對于維持神經干細胞的活性發揮至關重要的作用［9］，還能調節交感神經元的發育［10］，心臟內神經細胞的分化［11］。在脊椎動物中已經發現了4種Notch受體分子（Notch 1-4） 及五種配體（Jagged 1，2；Delta 1，3，4）。Sander GR.等人發現存在于腸神經系統的兩種Notch信號通路分子，即Notch-1及Jagged-2均表達于MP的神經節處［12］。

表2 各組別Notch-1 mRNA及Notch-1蛋白定量對比結果（x±s）Tab.2 The expression of Notch-1 mRNA and protein in normal and ARM groups（x ±s）

基于Notch-1及Jagged-2在腸管發育中的角色，我們利用ETU致畸的ARM動物模型觀察Notch-1及Jagged-2在畸形發生后末端直腸的表達，以期得到一些有益的啟示。

本研究結果證明，在直腸胚胎發育中，Notch-1/Jagged-2在腸壁肌肉及神經系統中均有表達，與兩者的發育過程同步，隨著腸道發育的成熟，Notch-1/Jagged-2的表達也逐漸增強，實驗結果提示Notch-1/Jagged-2信號分子在腸管的發育過程中，主要位于腸管的MP和腸壁平滑肌的環肌層，推測其可能對腸管神經肌肉發育起一定的的調控作用。

在ARM組，結果表明胚胎E16時，未見到陽性表達的細胞；E17后直腸壁內出現陽性細胞，上位結腸可見大量陽性細胞位于腸壁內；隨著接近盲端，腸壁各層分化不良，陽性細胞分布逐漸減少，橫斷面上更顯示出瘺管周圍肌肉形態異常，也不能看到神經叢結構；E20~21，這種變化更加明顯，Western Blot的實驗結果與組化結果一致。RT-PCR的結果證實了上述基因mRNA水平的改變，與正常組相比，Notch-1及Jagged-2的表達明顯降低。根據Notch-1及Jagged-2基因在ARM動物模型直腸壁表達水平的差異，推測它們可能與ARM末端直腸神經肌肉發育不良存在相關性。

Notch信號通路的調控機制非常復雜，如果揭示上述發育基因的確切調控機制仍然需要大量的深入實驗。這也正是我們課題組下一步的研究方向，目前正在進行中。

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