神經激肽1受體拮抗劑WIN62577對大鼠氣道平滑肌細胞增殖和遷移的影響

李淼，尚云曉，相云

（中國醫科大學 附屬盛京醫院小兒呼吸內科，沈陽 110004）

神經激肽 1受體（neurokinin-1 receptor，NK-1R）是感覺神經肽P物質的受體，P物質通過NK-1R起作用，其效應包括氣道收縮、血管擴張和血漿滲出、增加微血管滲透性。P物質及其受體在哮喘氣道表達增高，參與哮喘的發病機制。P物質受體拮抗劑已被廣泛應用于臨床，大多應用于臨床減輕疼痛、抗抑郁治療、抑制皮炎。P物質受體拮抗劑對于氣道炎癥的作用處于試驗階段，有實驗證明NK-1R特異性的受體拮抗劑靜脈注射可以減輕由于吸煙導致的肺損傷和香煙導致的氣道炎癥［1］，也有研究證明NK-1R拮抗劑可以減輕機械通氣引起的細胞因子增高的不良反應［2］。氣道平滑肌細胞（airway smooth muscle cell，ASMC）是氣道內的效應細胞，受氣道內各種因素，尤其是各類免疫細胞釋放的細胞因子和炎性介質的調節，產生相應的收縮反應，調節氣道的口徑，從而影響呼吸功能。在持續哮喘的病例中，在細胞外基質的影響和各種細胞因子、炎性因子和生長因子的作用下，ASMC會出現增殖和遷移性生長的現象。白細胞介素 13（interleukin-13，IL-13）對 ASMC 有促進增殖的作用。因此，本研究通過IL-13誘導ASMC增殖后給予NK-1R拮抗劑WIN62577，觀察WIN62577對大鼠ASMC生長曲線及細胞周期的影響，試圖說明WIN62577對ASMC增殖的作用；并通過Transwell小室方法研究WIN62577對大鼠ASMC遷移的作用，試圖探討WIN62577對哮喘大鼠氣道的作用，為哮喘的治療尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

雌性Wistar大鼠，6~8周齡，體質量150~160 g，共15只，中國醫科大學中心實驗室動物部提供；飼養期間給予正常飲食，飼養條件一致。DMEM培養基、胎牛血清，購自美國Hyclone公司；抗α平滑肌肌動蛋白單克隆抗體，購自武漢博士德公司；MTT、胰蛋白酶、NK-1R拮抗劑WIN62577，購自美國Sigma公司；FITC山羊抗兔熒光二抗、Ⅳ型膠原酶，購自美國GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠ASMC原代培養：參照文獻［3］，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（30 mg/kg）麻醉后，左心室取血處死。無菌分離大鼠氣管，仔細剝離外膜，去除內膜。將氣管平滑肌剪下，用含雙抗的DMEM培養液清洗后，將組織剪碎用0.1%的Ⅳ型膠原酶于37℃水浴下消化30 min兩次，待液體渾濁時用含10%胎牛血清的DMEM終止消化。1 000 r/min離心后用含10%胎牛血清DMEM重懸，200目濾網過濾后37℃、5%CO2孵育箱培養。3 d換液，7 d長滿培養瓶。用0.25%胰蛋白酶消化傳代后，利用成纖維細胞貼壁較快的特點純化ASMC，取第4代細胞用于檢測。

1.2.2 ASMC的鑒定：倒置顯微鏡下觀察，ASMC呈梭形或多角型，呈谷峰樣改變。以抗α平滑肌肌動蛋白單克隆抗體進行免疫熒光FITC染色鑒定，胞漿呈綠色熒光的細胞為平滑肌細胞。陰性對照組用PBS代替抗α平滑肌肌動蛋白單克隆抗體。熒光倒置顯微鏡（IX51，日本OLYMPUS公司）下觀察照相。

1.2.3 MTT比色法分析WIN62577對IL-13誘導的大鼠ASMC增殖的影響：按照隨機分組的原則將第4代ASMC分為空白對照組、IL-13干預組和WIN62577+IL-13干預組。IL-13干預組用含IL-13（1×10-5g/L）的 DMEM 培養液干預；WIN62577+IL-13干預組用含 IL-13（1×10-5g/L）及 WIN62577（1×10-8g/L）的DMEM培養液干預；空白對照組用PBS代替IL-13及WIN62577。將處于對數生長期的第4代ASMC以2×104/ml的密度接種于96孔板，先用無血清的DMEM培養液培養24 h達到同步化。給予干預因素24、48和72 h后，每孔加MTT溶液（5 mg/ml）20 μl，繼續孵育 4 h，終止培養，小心吸棄孔內上清液，每孔加150μl DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分融解。酶聯免疫監測儀490 nm波長測定各孔吸光度值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制細胞生長曲線。每組加5個復孔，實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞儀檢測WIN62577對大鼠ASMC細胞周期的影響：實驗分組同MTT比色法。將處于對數生長期的第4代ASMC調整為每瓶2×106/ml的密度，先用無血清的DMEM培養液培養24 h達到同步化。給予干預因素24 h后，0.25%胰酶消化收集細胞，70%乙醇固定過夜，給予RNA酶50 mg/L及溴化乙錠100 mg/L，4℃避光30 min檢測。計算G1、S和G2期細胞的比例。實驗重復3次。

1.2.5 Transwell小室檢測WIN62577對ASMC遷移的作用：用正常大鼠5只原代培養第4代ASMC，當ASMC生長至80%融合時，用0.25%的胰酶消化細胞，用含10%胎牛血清的DMEM以1×105/ml密度重懸細胞，下室加入含 WIN62577（1×10-8g/L）和 10%胎牛血清的DMEM培養液600μl，上室加入細胞懸液100μ1，將小室置于37℃孵育箱，24 h后取出小室，小心取出濾膜，棉簽輕輕擦去微孔膜朝上一面未穿膜的細胞。膜下面的ASMC用4%多聚甲醛固定20 min，蘇木素染色10 min，二甲苯透明1 min，中性樹膠封片，倒置顯微鏡（×400）下隨機計數5個視野的細胞數，取均值。每次5個復孔，實驗重復3次?？瞻讓φ战M給予相同劑量的PBS代替WIN62577。

1.3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析。實驗結果以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫熒光鑒定ASMC

當細胞長至融合狀態呈峰谷改變時進行傳代，用第4代ASMC作為實驗對象。用兔抗大鼠αactin、山羊抗兔FITC免疫熒光二抗染色鑒定ASMC，胞漿呈綠色熒光著色的細胞為ASMC。見圖1。

2.2 WIN62577對IL-13誘導的大鼠ASMC增殖的影響

IL-13干預組ASMC增殖較空白對照組ASMC明顯，24 h開始增殖，48 h達高峰，48和72 h兩組比較差異有統計學意義（P<0.05）；WIN62577+IL-13干預組與IL-13干預組及空白對照組比較，48及72 h ASMC增殖的差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 WIN62577對大鼠ASMC細胞周期的影響

WIN62577+IL-13干預組ASMC各細胞周期的細胞比例分別為 G1期（85.0±2.5）%、S期（4.5±3.7）%、G2期（9.5±1.4）%，IL-13 干預組為 G1期（80.2±6.2）%、S 期（6.9±2.1）%、G2期（12.9±5.2）%，空白對照組為 G1期（75.2±5.2）%、S期（8.6±2.8）%、G2期（16.2±3.4）%。WIN62577+IL-13干預組 ASMC 大多停留于G1期，與IL-13干預組及空白對照組相比各期細胞比例的差異均有統計學意義（P均<0.05）。

2.4 Transwell小室分析WIN62577對ASMC遷移的作用

正常 ASMC 24 h 遷移細胞數為（23±3）/HP；加入WIN62577干預后ASMC遷移數為（16±2）/HP，與正常ASMC比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3。

3 討論

哮喘是由多種細胞及其細胞組分參與的慢性氣道炎癥，氣道重塑是哮喘的重要特征。哮喘氣道重塑的病理特點包括平滑肌細胞增生、肥大、氣道上皮下纖維化、黏液化生、細胞間質的重塑及血管增多等。哮喘時ASMC是很重要的效應細胞，在多種細胞分泌的細胞因子、炎性介質的作用下尤其在哮喘氣道重塑時，ASMC產生收縮、增殖、遷移等生物學效應。

IL-4和IL-13是TH2淋巴細胞釋放的主要的促炎因子［4］，在氣道疾病的發生發展中起到重要的作用。這兩種細胞因子改變氣道的完整性，導致氣道對各種刺激的反應敏感性增加［5］。有學者通過動物實驗證明IL-13基因敲除小鼠發生氣道高反應性和氣道重塑的幾率減小，可見IL-13在哮喘氣道高反應性和氣道重塑中起到重要作用［6］。增加平滑肌細胞的體積或改變平滑肌細胞的收縮特性都可以改變氣道的反應性［7］。有研究報道，IL-13可以直接作用于平滑肌細胞增加乙酰膽堿對氣道的高反應性［8］。由此可見，IL-13對氣道平滑肌細胞的作用在哮喘的發生發展中起到重要的作用。IL-13可以促進ASMC增殖，參與氣道重塑［9］，因此，本研究通過MTT及流式細胞儀分析證明NK-1R拮抗劑有抑制IL-13介導的ASMC增殖的作用。MTT實驗證明WIN62577對ASMC增殖的抑制作用從24 h開始，48 h達高峰。流式細胞儀分析提示ASMC細胞在給予WIN62577后大多停留于G1期。細胞周期有兩個關鍵的調定點，包括G1/S、G2/M的轉換。WIN62577將ASMC調定于G1期，G1期關系到整個細胞周期的啟動，而G1期向S期轉變的關鍵是細胞周期蛋白D。因此，NK-1R拮抗劑對細胞周期蛋白D及其他調控基因的作用有待進一步研究。另外，IL-13的生物活性是通過與細胞表面相應的IL-13受體結合，從而激活細胞內蛋白質酪氨酸而完成的，而P物質是通過與其特異性NK-1R結合后，通過G蛋白與第二信使磷脂酸肌醇二磷酸相聯系，并通過三磷酸肌醇作用于膜上的鈣離子通道，引起膜電位的去極化和蛋白激酶活性改變而發揮作用的［10］。NK-1R拮抗劑通過什么途徑抑制IL-13誘導的細胞增殖有待進一步研究。

哮喘時嗜酸性粒細胞、肥大細胞等多種細胞分泌細胞因子及炎性因子參與哮喘的發生發展。有學者通過實驗證明P物質對哮喘患者嗜酸性粒細胞有活化和趨化作用［11］，本研究通過Transwell小室實驗證明WIN62577有抑制平滑肌細胞遷移的作用。

綜上所述，WIN62577有抑制ASMC增殖和遷移的作用，為治療哮喘新藥的開發提供理論依據。

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